一种海洋领鞭毛虫的分离与鉴定

一种海洋领鞭毛虫的分离与鉴定

贾晓燕;熊源;黄凌风;林施泉;陆家昌;吴林南;李玲

【摘 要】采用微液滴操作法在厦门海域分离培养了一株海洋鞭毛虫C6,运用显微镜观察和18S rDNA基因技术鉴定其种类,并将其与GenBank中已知的14种海洋鞭毛虫18S rDNA序列比较,用NJ法和UPGMA法构建系统发育树.通过PCR扩增获得1 774 bp 18S rDNA序列,与NCBI已登陆的其他同源序列进行系统分析,结果显示此海洋鞭毛虫属于领鞭毛虫(choanoflagellates).与已知种Monosiga

brevicollis的相似性为99％,为进一步研究该种鞭毛虫提供了遗传背景,但要明确其种类还需其他研究佐证.

【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2015(054)003

【总页数】4页(P436-439)

【关键词】海洋鞭毛虫;分离;18S rDNA;分子鉴定

【作 者】贾晓燕;熊源;黄凌风;林施泉;陆家昌;吴林南;李玲

【作者单位】厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102;厦门大学环境与生态学院,福建厦门361102;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102

【正文语种】中 文

【中图分类】Q945.11

异养鞭毛虫(heterotrophic flagellate)在海洋中分布广泛,从河口区到大洋区,从热带到极地海域,都能发现其存在[1].异养鞭毛虫是重要的细菌捕食者,能通过摄食作用影响细菌的群落组成,是海洋微食物环的重要组成部分,在海洋生态系统物流、能流中发挥着重要作用[2].在鞭毛虫分布调查中,领鞭毛虫(choanoflagellates)是常见的海洋异养鞭毛虫[3],领鞭毛虫的领由一圈伪足组成,捕食的时候利用一根鞭毛激起水流,通过领来过滤悬浮颗粒物——主要是细菌.这个类群的种类很多,它们之间的形态略为不同,依靠细胞覆盖物的形状和组成来区分.作为与后生动物最接近的单细胞生物,领鞭毛虫具有重要的进化地位,但对领鞭毛虫的分子发育系统研究仍然有限[4].由于海上调查条件有限,不易对其进行分离培养,且鞭毛虫个体微小,普通光学显微镜下难以通过形态观察进行准确分类.

本研究采用微液滴操作法在厦门附近海域分离并纯化一种海洋鞭毛虫,借助显微镜初步判断为领鞭毛虫,进一步利用18S r DNA序列的扩增和测序分析,并与Genbank中已知种类进行比对,确定其种类.目前关于海洋鞭毛虫的研究,大部分是以一个“黑箱”来处理,因此,我们对该鞭毛虫的分离与鉴定不仅有助于揭示异养鞭毛虫的种类组成及遗传背景研究,对进一步研究异养鞭毛虫的生态作用有积极意义.

1.1 材 料

本实验所用海洋鞭毛虫是由厦门大学海洋生态学实验室在厦门大学附近海域分离培养得到的单种株(C6).Taq酶等PCR所需试剂购自TakaRa公司;凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit)与其他生化试剂均购自上海生工生物股份有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 鞭毛虫的分离纯化

微液滴操作法[5]:用自制毛细管从天然海水中吸取微量液体在显微镜下确认液滴中鞭毛虫的数量,如只有一个鞭毛虫,利用吸管的毛细作用重新吸回液滴,并转移到预先

备好的培养液中.将挑好的个体放在20～25℃下培养,培养液为添加酵母提取物(终质量分数为0.01%)的过滤海水,并接种从海水中分离的细菌作为异养鞭毛虫的食物.培养约3～4 d后取样在400和1 000倍显微镜视野下观察,确认是否成功分离出纯种.异养鞭毛虫的细胞外观、鞭毛数量和形态、游泳行为作为是否为纯培养的判断依据.通常分离2～3次后能达到纯化的效果.

1.2.2 显微镜样品处理

取1 m L处于指数生长期的鞭毛虫培养液,加入10μL Lugol′s试剂固定,在Leica

FW4000荧光显微镜下观察其形态特征.

取10 m L经戊二醛固定的样品,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,最终质量浓度为5μg/m L)染色10 min后,低压(＜20 kPa)过滤到0.22μm的Millipore黑膜上,在紫外和蓝色激发光下利用显微镜观察其形态特征.

1.2.3 总DNA的提取和PCR扩增

取单种培养的鞭毛虫培养液2 m L,离心弃上清.用酚-三氯甲烷方法[6]提取总DNA.

PCR扩增引物见表1.扩增条件:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,55℃退火1

min,72℃延伸2 min,30个循环;72℃延伸10 扩增结果用1%(质量分数,下同)琼脂糖进行电泳检测.

1.2.4 PCR产物的克隆和测序

将PCR产物用上海生工凝胶回收试剂盒回收后,将目标片段连接到质粒载体PMD18-T上,转入细菌DH5α.测序由南京金斯瑞公司完成.

1.2.5 序列分析

在NCBI服务器上用Nucleotide Blast进行同源检测,将测得的序列和其他相关鞭毛虫序列,用计算机软件进行计算分析.应用Clustal X 1.83进行多序列对位分析,应用MEGA 3.1软件NJ法和UPGMA法建立系统树,用Maximum Composite

Likelihood计算遗传距离值,重复1 000次计算bootstrap值,节点数值表示1 000

次重复抽样所获得的自检支持百分率.

2.1 鞭毛虫的形态学特征

在光学显微镜下(1 000×)该类鞭毛虫细胞体呈梨形(见图1(a)),细胞长轴3～5μm,一根长鞭毛,长度是体长的1～2倍.该鞭毛虫多营自由生活,常单细胞生活,不与相同种类的其他个体形成群体(见图1 (a)和(b)).在光学显微镜下,不易观察其领状结构.该类鞭毛虫无色素,在荧光显微镜下观察,蓝色激发光下未见有红色发光(叶绿素特征,见图1(c)),因此可以断定该类群鞭毛虫是异养鞭毛虫.该鞭毛虫运动方式以直线运动为主,可通过螺旋式旋转来改变运动方向,在水体中主要营浮游生活.

2.2 18S r DNA序列的扩增和序列分析结果

对C6基因组DNA(见图2(a))使用真核生物18S r DNA通用引物,PCR扩增得到的目的片段(见图2 (b)),经过1%琼脂糖电泳分析,DNA片段为1 700 bp左右.由测序结果得知目的片段为1 774 bp, G和C所占比例为45.77%.将该18S r DNA序列(Genbank登陆号为KM387288)进行BLAST搜索,序列覆盖度在90%以上的同源性序列100条,最大序列相似度(maximum identification)在90%以上的有38条,其中与Monosiga brevicollis的18S r DNA相似度最高,达到99%.

用MEGA3.1软件按照NJ法(图3)和UPGMA两种方法构建系统发育树.用两种方法建立的系统发育树树形几近相同,而且在每个系统发育树中C6与Monosiga

brevicollis的节支点的支持率都很高,分别为99(NJ法)和100(UPGMA法).从本实验所构建的系统发育树可知,这15种鞭毛虫主要分成两簇.一簇主要由领鞭毛虫(Monosiga brevicollis和Monosiga ovata Hoglet),双并鞭类(Uncultured

bicosoecid,Siluania monomastiga和Neobodo designiss)以及分类地位不明确的Pleurostomum flabellatum组成;一簇主要由波豆类(Bodo caudatus和Rhynchomonas nasuta)和分类地位不明确的种类(Dysnectes brevis和Dimastigella trypaniformis)组成以及一种Placididea,一种双并鞭类和一种隐藻

类.为进一步分析此种与其他鞭毛虫的亲缘关系,将所有序列用MEGA3.1计算它们之间的遗传距离值.C6与已知的14中鞭毛虫的遗传距离为0.296～6.536,其中与Monosiga brevicollis的遗传距离最小,为0.296.

将C6的序列与基因库中已知的14种海洋鞭毛虫序列进行比较可知与本种最接近的是Monosiga brevicollis,用Kimura 2-parameter计算C6与Monosiga

brevicollis遗传距离值,重复1 000次计算bootstrap值为0.282,小于0.3,小于种间遗传距离的范围,二者应为同一种.从形态学上观察,此鞭毛虫为单细胞生长,细胞大小为3～5μm,这与Atkins的研究结果[8]一致.Atkins报道[8]Monosiga

brevicollis大小为3～7μm,但是该报道中长鞭毛的长度为5倍体长,而此种为1～2倍体长.长鞭毛长度差异的存在可能是在Lugol′s或戊二醛试剂固定时,长鞭毛脱落或损伤造成的.通过以上形态学和分子生物学分析推测,C6应为领鞭毛虫的Monosiga brevicollis.在光学显微镜下观察不易发现领状结构,有待于电镜结果佐证.

领鞭毛虫是世界性广布种,从海洋到淡水,从极地海域到热带海域都有其种类报道[9-12].有研究表明领鞭毛虫主要以细菌为食,同时也是海洋微型浮游生物和有机碎屑的初级消费者,因此领鞭毛虫的丰度与同群落中的其他微微型浮游生物关系密切,且领鞭毛虫的密度与初级生产力成正相关,这就决定了领鞭毛虫在微食物环和碳循环过程中的重要作用[9].但是领鞭毛虫的系统分类地位一直是个争论的问题.Levine等[13]1980年确定它隶属于原生动物亚界,肌鞭毛门,动鞭毛纲,领鞭毛目.1991年Patterson等[3]从鞭毛虫的形态和功能作用对异养鞭毛虫重新定义,领鞭毛虫即为其中一类.产生这种分类结果的原因可能是由于之前有关海洋鞭毛虫的研究较少,在基因库中能搜索到的,可用比较的序列有限.不过从已有结果可知,领鞭毛虫与双并鞭类的亲缘关系较近.Monosiga brevicollis是多细胞动物现存最近的单细胞亲缘种,同时它也被看做是连接真菌与多细胞生物之间的重要纽带.King等[14]2008年发

表了Monosiga brevicollis的基因组系列研究表明,该基因组具有富含内含子(intron)的基因,它们是一些编码蛋庄区域,其特征是与细胞黏附及动物的细胞外基质相关.因此对海洋领鞭毛虫尤其是Monosiga brevicollis的深入研究有助于了解多细胞生物的起源.本研究从海水中分离纯化得到一种鞭毛虫,从形态学和核酸序列进行分析,显示此种应为Monosiga brevicollis,从而为研究其生理生态特征,及进一步进行开发利用等提供了遗传背景.

【相关文献】

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