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DAP

葡萄是一种营养丰富、美味可口的水果，深受世界各地消费者的喜爱。近年来，无籽葡萄也越来越受大家的欢迎，因此，无籽葡萄品种的培育成为一个重要的育种目标，而了解葡萄种子发育的分子遗传调控机制对于无籽栽培品种的培育至关重要。

西北农林科技大学王西平课题组的研究成果，于2023年4月13日，发表在Horticulture Research期刊上(影响因子7.291)，文章题目为“Control of ovule development in Vitis vinifera by VvMADS28 and interacting genes”。该研究使用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）技术鉴定了葡萄中一个MADS-box转录因子的结合基序及其靶基因，揭示了VvMADS28参与葡萄胚珠和种子发育的调控机制，为培育无籽葡萄新品种奠定了理论基础。

MADS-box基因编码高等植物中的一大类转录因子，并在植物发育过程中发挥各种作用，包括花、果实和种子发育。MADS结构域蛋白通常以同型二聚体或异型二聚体的形式相互作用，从而扩展了功能多样性。在葡萄中，已经发现了几个参与种子形成的MADS-box基因（VviAGL11、VvAG2、VvSEP3、VvMADS39、VvMADS45）。该课题组在之前发表的工作中揭示了VvMADS45在葡萄种子发育中的作用，以及VvMADS39在花和胚珠发育中作用。本研究主要对MADS-box家族的VvMADS28进行进一步的功能验证及其分子调控机制的探究。

图1. VvMADS28的表达模式分析及亚细胞定位

本研究首先对葡萄中VvMADS28的时空表达模式进行研究。RT-qPCR检测发现，VvMADS28在有籽葡萄“红地球”和无籽葡萄“汤普森无核”的多种组织中普遍都有表达。其中，表达最强烈的组织是花序、花、果实，表达最弱的是根和叶。在胚珠发育过程中，VvMADS28在“红地球”30 DAF（开花后天数）表达最强烈，此后在“红地球”中的表达一直强于“汤普森无核”，而且“红地球”中VvMADS28基因的较强表达模式与种子发育相一致。此外，原位杂交实验发现，在2个品种的15 DAF胚珠中均能检测到VvMADS28的mRNA表达。“红地球”中在30 DAF和35 DAF时均有相对较强的表达。相比之下，“汤普森无籽”胚珠在25 DAF后几乎没有表达。该结果与RT-qPCR结果相似。以上这些结果表明，VvMADS28在珠被的形成中起重要作用。基因功能不仅由基因的时空表达模式决定，还与该基因产物的亚细胞定位有关。在拟南芥原生质体中表达携带GFP标签的VvMADS28，检测到荧光信号定位于细胞核，这表明VvMADS28是一个转录调控因子。

图2. “红地球”VvMADS28-RNAi 株系的果实和种子表型

通过ChIP-qPCR发现，在“汤普森无核”胚珠中VvMADS28的抑制与H3K27me3有关。在转基因番茄中VvMADS28的过表达，导致萼片增大、果实变小、种子数量减少，而种子大小没有显著的变化。与对照组相比，利用“红地球”构建的VvMADS28-RNAi株系表现为种子质量减少、果实和种子体积缩小、种子萎缩且排列不规格、种皮细胞排列松散。这些结果说明VvMADS28在维持正常的种子发育中起重要作用。

图3. VvMADS28启动子上游的结合基因分析

采用酵母单杂交（Y1H）技术鉴定到VvMADS28上游的一个调控基因VvERF98，该基因编码一个乙烯反应因子，它在2个葡萄品种中的表达模式与VvMADS28相似。此外，双荧光素酶报告实验、VvERF98-GUS 过表达实验进一步证明了VvERF98可以正调控VvMADS28的表达。随后，将种子用10 mM乙烯利处理，发现VvERF98和VvMADS28的表达水平均显著升高。这说明在种子发育过程中VvERF98是VvMADS28上游的一个转录调控因子，且可以响应乙烯信号。

图4. DAP-seq分析葡萄VvMADS28的结合基序及其潜在靶基因

采用DAP-seq技术鉴定了VvMADS28最显著富集的结合基序为CArG [序列是CC(A/T)6/8GG]，并筛选到4个与胚珠发育相关的潜在靶基因（WUSCHEL-related homeobox 1、HAIKU、DA、 INNER NO OUTER）。Y1H实验证实VvMADS28只与VvWUS 启动子有相互作用。另外，EMSA、双荧光素酶报告实验也证实了VvMADS28与VvWUS启动子的互作。以上结果说明，VvMADS28通过结合VvWUS 启动子中的CArG（ctattatatag）位点，抑制葡萄中VvWUS的表达。

采用酵母双杂交（Y2H）技术，筛选了葡萄胚珠发育相关的VvMADS28的互作蛋白，并鉴定到VvMADS5蛋白。利用Co-IP、split-LUC互补分析，进一步验证了VvMADS28与VvMADS5之间的互作关系。

为进一步阐明VvERF98、VvMADS5和VvWUS在种子发育中的相互作用，于是利用拟南芥分别构建了每个基因相应的转基因株系，以便开展功能分析。在OE-VvMADS5株系中，叶片和角果增大、种子大小和重量增加，说明VvMADS5在胚珠和器官发育中起重要作用。同样，在OE-VvERF98株系中，种子也增大，说明VvERF98 参与了胚珠的发育。相反，在OE-VvWUS株系中，叶片扭曲并产生簇状分支、角果和种子缩小。VvWUS的mRNA在“汤普森无核”胚珠中高度积累，而VvMADS5和VvERF98的表达模式却与之相反。

图5. VvMADS28调控种子发育的分子机制网络模型

总结：在葡萄发育过程中，VvERF98特异性地结合到VvMADS28启动子上，正调控VvMADS28的表达。VvMADS28相对较低的表达水平与其启动子区域H3K27me3抑制标记的增加有关。VvMADS28特异性地与VvWUS启动子区的CArG基序结合，抑制VvWUS的表达，且VvMADS28（MADS-box II型MIKC分支）可与VvMADS5（MADS-box I型Mβ分支）互作协同调控这一过程。因此，VvMADS28-VvMADS5二聚体的维持以及VvWUS的表达稳态，影响了葡萄花器官分化以及珠被细胞和胚乳细胞的发育。总之，该研究揭示了VvMADS28在葡萄种子发育中的作用及分子机制，为无籽葡萄新品种的培育提供了宝贵的基因资源。

参考文献：Zhang S, Wang L, Yao J, Wu N, Ahmad B, Nocker S, Wu J, Abudureheman R, Li Z, Wang X. Control of ovule development in Vitis vinifera by VvMADS28 and interacting genes. Horticulture Research. 2023. uhad070. .1093/hr/uhad070.

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