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2024年1月23日发(作者：中国异步fifo发展趋势)
通则 3407 外源性 DNA 残留量测定法第三法公示稿
定量 PCR 法
PCR 反应过程中可通过荧光标记的特异性探针或荧光染料掺入而检测 PCR
产物量，通过连续监测反应体系中荧光数值的变化，可即时反映特异性扩增产物量的变化。在反应过程中所释放的荧光强度达到预设的阈值时，体系的 PCR 循环数(Ct 值)与该体系所含的起始 DNA 模板量的对数值呈线性关系。采用已知浓度的
DNA 标准品，依据以上关系，构建标准曲线，对特定模板进行定量分析， 测定供试品中的外源 DNA 残留量。
试剂 （1）PCR 反应预混液（2×) 含 MgCl2、扩增酶、dNTPs 等，按试剂使用说明书要求配制，或符合条件的其它配方预混液。
（2）
TE 缓冲液（pH 8.0）同方法一。
（3）
荧光标记探针 用 TE 缓冲液稀释至 100μmol/L，-20℃保存。
（4）
正向和反向序列检测引物 用 TE 缓冲液稀释至 100μmol/L，-20℃保存。
（5）
碘化钠溶液（6mol/L 碘化钠，15 mmol/L EDTA，0.5%月桂酰肌氨酸钠，
25mmol/L Tris-HCl pH 8.0 以及 35µg/ml 糖原）：配制 100ml 碘化钠溶液，先取干净的烧杯置于磁力搅拌器上，依次加入以下成分，同时用搅拌子不断搅拌混匀：
50ml 的无核酸酶水，3.0 ml 的 0.5 mol/L EDTA 溶液，2.5ml 的 1 mol/L Tris-HCl pH
8.0，缓慢加入 89.93g 的碘化钠，加入适量的无核酸酶水至 100 ml（可根据需要等比增加或减少）。用 0.2 微米孔径的尼龙膜过滤溶液。避光 4℃储藏。
（6）2%蛋白酶 K 溶液 同方法一。
（7）
蛋白酶 K 缓冲液（10×），同方法一但不加氯化钠，或按蛋白酶 K 试剂说明书要求配制。
（8）
推荐的检测探针及引物
CHO 细胞
探针: 5ˊFAM-ACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGC-TAMRA3ˊ
正向引物: 5ˊ-TGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCT-3ˊ
反向引物: 5ˊ-CAGCACTCGGGAGGCAGA-3ˊ
大肠杆菌
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