ASH2L在上皮性卵巢癌中的表达及其对SKOV-3细胞系增殖的影响

安徽医科大学学报

Acta

UniveTsitatis

Meyicinalis

Anhui

2021

Mar；56(3)・445・网络出版时间：2021

-2

-5

14

：30

网络出版地址：htRs：//kns.

cnki.

neRkcms/demil/34.

1065.

R.

20210205.

1050.

020. htmlASH2L在上皮性卵巢癌中的表达及其

对SKOVP细胞系增殖的影响

孙

超,孙士莹，詹磊，卫兵,王文艳摘要目的探讨混合谱系白血病（MLL）甲基转移酶的核

心亚单位ASH2L对人上皮性卵巢癌细胞系SKOVT增殖的

影响。方法免疫组化方法检测上皮性卵巢癌组织标本中

ASH2L的表达会通过甲基化修饰的途径影响细胞

的发生发展及癌变。目前尚无关于ASH2L在卵巢

癌中的相关性研究，该研究旨在观察ASH2L在上皮

ASH2L蛋白表达的定位。Western

blot法检测卵巢癌组织标

本和正常卵巢组织标本中ASH2L的表达水平,以及卵巢癌

细胞系SK0VT中ASH2L的表达水平。采用ployplus试剂

介导ASH2L质粒转染,通过Western

blot法验证ASH2L的转

染效率，并利用CCKT法检测转染后SK0VT细胞的增殖情

况。结果ASH2L蛋白表达定位于卵巢癌组织细胞核内。

与正常人的卵巢组织相比，上皮性卵巢癌组织中ASH2L蛋

白表达水平上调（5

<

0. 01）,与293T细胞系相比，SK0VT

细胞系中ASH2L蛋白表达水平上调#

5

<

0.

05

）。SK0VT

细胞系在转染ASH2L质粒后，细胞中ASH2L蛋白的表达升

高，与空载质粒转染的SK0VT细胞相比,ASH2L质粒转染

的SK0VT细胞增殖增力叭5

<0.

01）o结论

ASH2L在上皮

性卵巢癌中表达升高。高表达的ASH2L可促进卵巢上皮性

肿瘤细胞SK0VT的增殖。关键词ASH2L；表观遗传学;上皮性卵巢癌;细胞增殖中图分类号R711.75文献标志码A

文章编号1000

-1492（2021）03

-0445

-04

doi：

10.

19405//

cnki.

issnlOOO

-

1492.

2021.03.

021卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，死亡率位于妇科

恶性肿瘤首位。表观遗传学的研究对恶性肿瘤的预

防和治疗有着重要的意义。有研究［1-4］表明：组蛋

白H3K4甲基化修饰可影响肾癌、肺癌、胰腺癌、乳

腺癌及胃癌等多种恶性肿瘤的预后。在哺乳动物体

内，混合谱系白血病（mixed

lineage

leukemic,

MLL

）

甲基转移酶能够参与家族蛋白调节H3K4的组蛋白

修饰，而ASH2L是MLL甲基转移酶的核心亚单位

之一⑸。ASH2L的表达缺失,会使MLL复合体进

行H3K4三甲基化修饰的水平降低⑷。因此,2020

-

10

-28

接收基金项目：国家自然科学基金（编号：81801511）；中国博士后科学基

金（编号：2016M592038）作者单位:安徽医科大学第二附属医院妇产科，合肥230601作者简介:孙超，男,硕士研究生；王文艳，女，主任医师，教授，硕士生导师，责任作者，Email:

wenyanautumn@

sina.

com性

癌中的表达及 性

性

SKOVT增殖的影响。1材料与方法1.1材料1

-1.1细胞系

人卵巢癌细胞系SKOVT及人肾

上皮细胞系293T（中国科学院上海细胞库），保存于

安徽医科大学第二附属医院中心实验室。细胞系用

含有10%的胎牛血清、1%链霉素及青霉素的

DMEM培养基培养，置于37

°C、5%

CO和饱和湿

度的恒温培养箱中。1.1.2

标本收集

选取2018年3月—2019年7月

因卵巢癌和同期因绝经后子宫良性疾病在安徽医科

大学第二附属医院妇科行手术治疗的20例患者为

研究对象。卵巢癌患者10例,因子宫良性疾病行子

宫双附件切除的患者10例（子宫肌瘤患者6例，子

宫腺肌症患者3例,子宫内膜息肉1例）。卵巢癌组

患者手术前均未接受辅助化疗;绝经后子宫良性疾

病组患者术前未接受性激素治疗。卵巢癌组患者年

龄为42

-65

（52

±6.

62）岁；子宫良性疾病组患者年

龄为50

-58（53

±

2.

63

）岁。卵巢癌组术后卵巢组

织病理均为卵巢浆液性乳头状腺癌。子宫良性疾病

组患者术后卵巢病理结果均提示卵巢正常。本研究

经安徽医科大学第二附属医院伦理委员会同意。1.1.3感受态细胞DH5+（上海生工生物工程股

份有限公司）保存于安徽医科大学第二附属医院中

心实验室，置于-80

C冰箱中。1.1.4

主要试剂

ASH2L抗体（美国BETHYL公

司）；0-actic多克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠

二抗、ECL发光试剂盒（美国affinity公司）；PVDF

膜（上海Biosham公司）；胎牛血清、高糖DMEM液

体培养基（美国Gibce公司）；免疫组化试剂盒（武

汉赛维尔生物科技有限公司）；ASH2L质粒及空载

质粒（美国Addgena公司）；质粒提取试剂盒（广州

-446

-安徽医科大学学报

Acta

Unnersitatis

Medicinalis

Anhui

2021

Mvs；56(3)美基生物科技有限公司）；jet/RIME

®试剂（法国

polyplus-transfection

公司）;CCK-8

试剂盒（上海七海

吸

的值，反复测量3次，取实验结果的平终结果。用$±$表示。相关试验均值作

复泰生物科技有限公司）。1.3

统计学处理

通过Graphpad

P/mc

7.

0软件

统计

，计

1.1.5

主要仪器

Heraeus

CO2恒温培养箱（德国Heraeus公司）;酶标仪（上海科

实验系统有限公

研究

均独立重复3

均值。独立两组均司）；高

温离心机（美国Eppendorf公司）；

CU420型

恒温水箱（

比较采用i检验 单

差

。P

<恒科

有限公司）；0.

05为差异有统计学意义。、显影仪（ 科

有限公司$

;

IMPLEN超微量分光光度计（江苏万科科教仪器有限公司$。2

结果1.2方法2.1免疫组化实验检测ASH2L在细胞中的表达1.2.1免疫组化

收集上皮性卵巢癌组织,制成石

蜡切片并脱蜡，放入

复盒中浸润

酸抗原修复缓冲液，

炉内加温抗原修复，使用3%过氧化氢阻断内源性的过氧化物酶，血清封闭

入一抗，复温

入对应的二抗，室温下孵育50

mN,滴亲

-过氧化物酶溶液，室温孵育10

mN，加入

的DAB染液，

约10

mN后显微镜情况。1.2.

2

Western

blot实验

提取组织或细胞系的总，利用BCA

，在制的凝胶板中加入样品和Marker，

%切、膜。转膜

，对带有

的PVDF条带依次进室温下5%脱脂牛奶封闭、洗膜,4

C下一抗

:孵育、洗膜，室温下二抗封闭1

h

%洗膜，

利用显

影

ECL显色，并图

与

。1.2.3转化及质粒扩增

将

本加入

i受态细胞DH5

+中

化，接

LB培养基中并37 C

养，养基中挑取单

菌落放入

含抗生素的LB培养液中37

C

%200〜250

r/min条

件下

摇菌培养，

利用

剂盒对菌液中的

，并

浓度。1.2.4质粒转染

当6

中

养细胞覆盖率满

意时，以

液:缓

液：jetPRIME

®试剂=1

:100

:

2的比例配制

混合物，并孵育10〜15mN，将6

中的培养基清洗并更新，孵结

'将

混合物加入其中，

37

C、5%

CO2的培养箱中，24

h

更换培养基,并继续放入培养箱中养，留用于后续实验。1.2.5

CCK-8实验

在细胞系转染后的24、48、72h 6

中的各

消化，并计数。将

浓度的

液接

96

中（100

*1/）,另有

入相应

的培养基作为空o

,将10

*的CCK-8溶液加入

中，

养箱内孵育4h,

酶标仪450

nm定位

性

癌

中,ASH2L的表达定位中（图1

）o图1卵巢组织免疫组化染色A：

x

100；B：

x4002.2

Western

blot实验检测组织中ASH2L蛋白的

表达

提取组织的总蛋白，Western

blot方法检测上

性

癌

正常

中ASH2L

的表达量，结果显示：

性

癌

的ASH2L蛋表达

高于正常

（图2）,两组间比较差异有统计学意义（PV0.01

）o正常卵巢组织上皮性卵巢癌组织ASH2Lp-actin图2

Western

blot法检测各组组织中蛋白表达情况与正常卵巢组织比较：**

P<0.

012.3

Western

blot实验检测细胞系中ASH2L蛋白

的

养人

癌

系SK0V-3及人肾上皮细胞系293T,提取两种细胞系的总蛋白，West­ern

blot方法检测SK0VE和293T细胞系中ASH2L

蛋白的表达量,结果显示：SK0V-3

系中ASH2L

安徽医科大学学报

Acta

Unmersitatis

Meficinalis

Anhui

2021

Mar；56#3

$-447

-蛋白的表达水平高于293T细胞(图3

),两组间比较

-»-ASH2L转染组-■-空载转染组差异有统计学意义(5<0.

05)o293T细胞组SKOV-3细胞组俎LO赳

®.屈a工.5

293T细胞组SKOV-3细胞组图3

Western

blot法检测 中蛋白与293T细胞组比较：*

5<0.

052-

4

CCKP实验检测转染质粒后细胞系的增殖情

况

对SKOVT

ASH2L质粒空载质粒转染，采用Western

blot方法检测转染后

ASH2L：

的表达量,验证SKOVT

中的

j效率。结果显示，与

空载质粒的SKOVT细胞相比，转染ASH2L质粒的SKOVT细胞中ASH2L蛋明显高表达，差异有统计学意义(5

<0.

01,图4)。SKOVT

的

24、48、72h,

空:ASH2L

的SKOVT

比研究，采用CCK-8实验验证，结果显示转染后24%48

72

h，ASH2L

较空

的

均有所增加，且两

的

差异

的延长逐渐

(图5

)，

差异有统计学意义(5

<0.01

)。ASH2L转染组空载转染组弐》««ASH2L转染组

空载转染组图4

Western

blot实验检测转染

蛋白与空

比较：**

5<0,

01％()弋»**同«10011-°

0

24 48

72时间(h)图5

CCKP检测细胞系增殖情况与空载转染组比较:5<0.01,

***

5<0.

0013讨论研究⑺

：血清中

甲基化DNA的表达水以反

的增生状态，可作

期诊断的标志物之一，而多重

特异性甲基化PCR检

作

的

性

癌早期诊断的

之DNA的不同修饰可以使染色体的结构和功能

发生

，

导基因表达以及

的

。人

基因图谱的研究⑻中：哺动物

IH3K4甲基

酶即MLL复合物的家族特异性基因异常与多

性

的发生发展、

相关。MLL酶以腺!甲硫氨酸为甲基供体，将甲基H3K4a-氨基上,完成H3K4的甲基化修饰，可分

MLL和SETI

A/C两类甲基化酶。MLL复合物的

核心蛋白包括WDR5、RbBP5、ASH2L及DPY30。相

关研究发现：

MLL复合物中的ASH2L核心蛋,导

MLL复合物酶活性的

。有

⑼表明，

中有ASH2L的参与：癌

MYC可与ASH2L发生相互作

癌、胰癌、喉癌肝癌、

癌、结肠癌及等

中均存在ASH2L的高表

^［10-11］；Qi

ata/12］的研究表明，

癌标本及相关癌

系内，存

ASH2L的高表达，且ASH2L的表达

与ER+相关；Cheng

at

a/13〕研究显示，肺癌的恶性程度受MMP9和ASH2L的表达水平调控，抑

制ASH2L的表达可以有效促进MMP9介导的肿瘤

的浸润

。ASH2L：

表达通过表

:学机制间接地影

性

的发生发展,该研究表明ASH2L：

性

癌中表达升高，高表达的

ASH2L

性

SKOVT

的,表明ASH2L与

癌同样有着密切的联系，参与它的发生发展，

中的具体机制还

将

・448・安徽医科大学学报

Ako

UnOersitatis

Meficinalis

Anhui

2021

Mar；56(3)中的应用价值研究[J]-中国医师协会妇产科医师大会,

2015:

485

-9.来更多的思考和实验来探索’参考文献(1)

Elsheikh

S

E

,

Green

A

R,

Rakha

E A,

et

al.

Global histonc mod­ifications

in

breast

canccr

correlate

with

tumcr

phenotypes,

prov-

nostic

factors,

and

patienf

outcome

(

J)

-

Canccr

Rcs,

2009

,

69

[

8

]

(

Kandoth

C,

McLeean

M

D,

Vandin

F,

onaeeand-

scapeand

signieicanceaceos12

macoecanceetypes[

J]

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)：

333

-9.[9]

Ul/us

A,

Luscher-CirzlafO J,

Costa

I

G,

et

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Thv

interaction

cf

(9)

:

3802

-9.(2)

Se/own

D

B,

Horvath

S,

McBrian

M

A,

et al.

Global

levels

cfhbtonc

modifications

predict

provnosis

in

dibemnf

cancers

(

J)-

MYCwith theteithoeaxpeotein

ASH2L

p

eomotes

gene

t

eansc

eiption

by

eegueating

H3K27

modieication[

J]

0NuceeicAcidsRes,

2014,

42(11)

:

6901

-

J

Pathol,

2009,

174(5)

:

1619

-28.[

10]

MageeeC,

EeingeeJ,

BeaunschweigT,

etae

H3K4

dimethyeation

in

hepatoceeueaecaecinomaiseaeecompaeed

with

otheehepatobiei-

ary

and

gashointes/nal

carcinomas

and

correlates

with

expression

[3]

Elingcr

J,

Kahl

P,

Mertens

C,

V

al.

Provnostic

relevance

cf

global

histonc

H3

lysinc

4

(

H3K4)

methylation

in

renal

cell cerci­nomv

[

J]

-

Int

J Cancer,

2010

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methyea,e

A,h2

and

the

demethyea,e

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Zhen

L,

Gui-lan

L,

Ping

Y,

et

t.

Thv

expression

cf

H3K9Ac,

H3K14Ac,

and

H4K20T

eiMe

in

epitheeiaeoeaeian

tumoesand

the

[11

]

Luschcr-CirzlafO

J,

Gaw/ste

I,

Vemoo/s

J,

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Thv

human

eeiehoeaxpeoeein

hASH2

eunceionsasan

oncopeoeein

[

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-6.[5

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Bhaumik

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ly-sine4

methyeteanseeeaseseeomyeasttohuman[

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QiJ,

HuoL,

Zhu

Y

T,

,

sma

eo

ehomeo

eic

2- eike

peoeein

(

ASH2L)

enhanceseheeeansceipeion

oeeheeseeogen

eecep-

[6

]

Wan

M,

Liang

J,

Xiong

Y,

V

al.

Thv

ththorax

gmup

proteinAsh2l

is

essential

for

pluripotency

and

maintaining

open

chromatin

in

embryonic stem

cells[

J]

-

J

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GATA3

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13

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ChengX,

YangY,

Fan

Z,

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poeeneiaees7ungcancee

ceemigeaeion

and

ineasion

byepigeneeicaeyaceieaeingMMP9

eean-

sceipeion[

J]

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34(

44)

:

5570

-81 .-48.[7]张

青，魏建军，孔北华-表观遗传学修饰在妇科肿瘤诊断

Expression

of

ASH2L

in

eeithelial

ovarian

cancer

and

effec

of

ASH2L

on

the

proliferation

of

SKOV-3

cell

line

Sun

Chav,

Sun

Shiying,

Zhan

Lei,

el

al(Dept

of

Obstetrics

and

GyoecKogy,

The

Second

Affiatep

Hospitalof

Anhui

MefOal

UnOersfa,

HfCt

230601)Abstract

Objective

Tv

explore

the

eVect of

ASH2L,

an

impo/ant

component of

the

core

subunit of

the

mixedeineageeeukemia(

MLL)

meehyeeeanseeasecompeex,

on

ehepeoeieeaeion

oXoeaeian

epieheeiaecaecinomaceeeine

SKOV-3.

Metiods

Immunohistochvlistry

was

used

to

detect

the

localization of

ASH2L

protein

expression

in

n

beotwasused

todetecttheexpeesion

eeeeeoXASH2Lin

oeaeian

cancee

Bssue

samples

and

normal

ova/an

tissue

samples,

and

the

expression

level

of

ASH2L

in

ova/an

malignant

tumor

cell

lines.

Polyplus

reagent

was

used

to

mediate

ASH2L

plasmid

transiction,

the

transiction

Vficiency

of

ASH2L

was

veified

by

Western

blot,

and

the

proliferation

of

SKOV-3

cells

after

hansf-tion

was

detected

by

CCK-8

meth­od.

RessUs

The

expression

of

ASH2L

was

located

in

the

nucleus

of

ova/an

cancer

tissues.

Compared

with

normal

ova/an

tissues,

the

expression

level

of

ASH2L

protein

in

ova/an

epithelial

cancer

tissues

was

upv-u/md

(P

<

0.01)

.Compaeed

with

293T

ce

eeine,

theexpee,ion

ee

ee

eo

eASH2L

p

eotein

in

SKOV-3

ceeeinewa,up-eegueated

(

P <0.05)

.AeteeSKOV-3

ceeeinewa,tean,eected

with

ASH2Lpea,mid,

theexpee,ion

oeASH2Lpeotein

in

the

ceeinceea,ed

with

SKOV-3

ce

et

ean,eected

with

empty

p

ea,mid,

thepeoeieeeation

oeSKOV-3

cee

transfected

with

ASH2L

plasmid increased

(

P

<

0.

01

)

-

Conclusion

ASH2L

R

highly

expressed

in

epithelia-

v-varian

cancer.

Increased

expression of

ASH2L

can promote

the

pmlibration of

ova/an

epithVial

tumor

woirs

ASH2L；epigenetics;epithelial

ova/an

cancer；cell

proliferation