脂肪肝细胞模型的研究进展

中国细胞生物学学报

Chinese

Journal

of

Cell

Biology

2020,

42(12):

2256-2265

DOI:

10

」

1844/cjcb.2020.

12.0017

脂肪肝细胞模型的研究进展

冯秋琪

「

任国艳X乔香君

2

柳嘉'夏凯彳

（

'河南科技大学,食品与生物工程学院

，

洛阳

471003;

2

郑州航空港经济综合实验区口岸业务服务局

，

郑州

4

51150;

'中国食品发酵工业研究院

，

功能主食创制与慢病营养干预北京市重点实验室

，北京

100015

）

摘要

脂肪肝是仅次于病毒性肝炎的第二大肝病.脂肪肝的发病率不断升高

，

且发病年龄日

趋年轻化

，

正严重威胁人类的健康

。

脂肪肝包含一系列病理症状

，

随病情进展

，

患者可发生脂肪性肝

炎

、

肝硬化和肝细胞性肝癌

。

一般而言

，

脂肪肝属于可逆性疾病

，通过早期诊断和及时治疗往往能

恢复正常

。

细胞模型是研究脂肪肝病理机制的重要途径.该文讨论了脂肪肝的发病机制

，

并从细胞

模型使用的细胞类型

（

动物和人的原代肝细胞

、

永生细胞系

、

诱导多能干细胞分化而来的类肝细胞

和精密肝切片

）

、

培养方式

（

单独培养

、

共培养

、

三维培养

）

和诱导方式

（

高脂

、

高糖和酒精

）

这三个

方面对近年来常用的细胞培养模型进行总结和分析

，

以期为脂肪肝的研究和药物筛选提供参考

。

关键词

酒精性脂肪肝

；

非酒精性脂肪肝

；

细胞模型

；

细胞系

Advances

in

Cell

Models

of

Fatty

Liver

Disease

FENG

Qiuqi',

REN

Guoyan

1

*

,

QIAO

Xiangjun

2

,

LIU

Jia

3

,

XIA

Kai

3

{^College

of

Food

and

Bioengineering,

Henan

University

of

Science

and

Technology,

L

uoyang

471003,

China;

~Port

Bureau

Of

Zhengzhou

Airport

Economic

Integrated

Experimental

Zone.

Zhengzhou

451150,

China;

'Beijing

Key

Laboratory

of

Innovative

Development

of

Functional

Staple

and

the

Nutritional

Intervention

for

Chronic

Disease,

China

National

Research

Institute

of

Food

and

Fermentation

Industries,

Beijing

100015,

China)

Abstract

Fatty

liver

disease

is

currently

one

of

the

most

common

liver

diseases

in

the

world,

and

it

has

be

­

come

the

second

largest

liver

disease

after

viral

hepatitis.

The

incidence

of

fatty

liver

disease

is

increasing,

and

the

age

of

onset

is

getting

younger,

which

is

a

serious

threat

to

human

health.

Fatty

liver

disease

contains

a

series

of

pathologi

­

cal

symptoms.

As

the

disease

progresses,

patients

may

develop

steatohepatitis,

cirrhosis,

and

hepatocellular

carcinoma.

Generally

speaking,

fatty

liver

disease

is

a

reversible

disease,

and

early

diagnosis

and

timely

treatment

can

often

lead

to

a

return

to

normal.

Cell

model

is

an

important

way

to

study

the

pathological

mechanism

of

fatty

liver

disease.

In

this

paper,

the

pathogenesis

of

fatty

liver

disease

is

discussed,

and

the

commonly

used

cell

culture

models

in

recent

years

are

summarized

and

analyzed

from

the

three

aspects

of

cell

type

(primary

hepatocytes

of

animals

and

humans,

immor

­

tal

cell

lines,

hepatocyte-like

cells

derived

from

induced

pluripotent

stem

cells,

and

precision-cut

liver

slices),

culture

mode

(monoculture,

coculture,

three-dimensional

culture)

and

modeling

method

(high-fat,

high-sugar

and

alcohol)

used

in

the

cell

model.

This

will

provide

reference

for

the

study

of

fatty

liver

disease

and

drug

screening.

Keywords

alcoholic

fatty

liver

disease;

nonalcoholic

fatty

liver

disease;

cell

model;

cell

lines

脂肪肝的主要特征是肝脏中脂肪沉积过度

，

患

者的临床表现有肝细胞炎症和肝纤维化等

。

脂肪

收稿日期:

2020-05-21

Received:

May

21

,2020

肝包括非酒精性脂肪性肝病

（

nonalcoholic

fatty

liver

disease,

NAFLD

）

和酒精性脂肪性肝病

（

alcoholic

fatty

接受日期:

2020-09-04

Accepted:

September

4,2020

liver

disease,

AFLD

）

,

区分

NAFLD

和

AFLD

的重要指

标是患者的饮酒情况,

AFLD

是过量饮酒导致的脂肪

*

通讯作者

。

Tel:

159****9597,

E-mail:

*****************

*Correspinding

author.

Tel:

+86-,

E-mail:

renguoyan@

URL:

/?id=54

15

肝，

而

NAFLD

是排除过量饮酒和其他特异性肝损伤

因素

，

与代谢综合征和胰岛素抵抗有关的疾病

，

其主

冯秋琪等

：

脂肪肝细胞模型的研究进展

2257

要特征是肝细胞内脂肪过度沉积⑴

。

目前

，

脂肪肝在全球的患病率日益增长

，

在亚

这样解释的

：

首先

，

机体由于各种原因出现胰岛素抵

抗和糖脂代谢紊乱，导致肝细胞内堆积大量的脂质,

洲

NAFLD

的发病率高达

29.62%

巴严重威胁公共健

形成

NAFLD,

这是肝脏受到的

“

首次打击

”

；

随后

，

细

康

，

应当引起公众关注

。

研究脂肪肝使用的手段有

胞内的脂质氧化产生活性氧自由基

(reactive

oxygen

动物模型和细胞模型

，

动物模型能模拟体内环境

，

但

species,

ROS),

引起氧化应激和炎症反应

，

肝细胞受

实验周期长

、

个体差异大

；

而细胞模型能克服个体

到损伤

，

形成非酒精性脂肪性肝炎

(nonalcoholic

ste-

差异的影响

，

更简便

、

高效

，

适于开展高通量的药物

atohepatitis,

NASH),

即

“

第二次打击

”

。

肝脏是机体

筛选和机制研究

。

国内外的研究人员根据脂肪肝的

糖脂代谢的重要器官

。

人体摄入食物后

，

消化酶将

特征建立了多种细胞模型

，

如采用高糖高脂和酒精

淀粉分解为单糖进入血液

，

血糖升高

，

促进胰岛素分

诱导细胞

，

检测细胞糖脂代谢的情况

，

建立脂肪肝细

泌

。

胰岛素调节血糖的途径有

：

(1)

促进外周组织对

胞模型

，

进而筛选出可以改善脂肪肝的食品功能因

葡萄糖的吸收利用

；

(2)

促进肝脏利用葡萄糖生成肝

子

。

下文将从细胞类型选择

、

细胞培养方式和干预

糖原

；

(3)

促进脂肪生成

，

抑制脂肪组织的脂解作用

。

条件这几方面来进行综述

，

以期为筛选药物和天然

当机体发生胰岛素抵抗时

，

机体的糖脂代谢会紊乱,

活性成分提供参考

。

形成脂肪肝和糖尿病同

。

NAFLD

患者肝脏脂肪来源主要有两个

。

(

1)

脂

1

NAFLD

的发病机制

肪组织中的甘油三脂分解的游离脂肪酸由血液运送

1.1

NAFLD

的发病机制

到肝脏

。

在这一过程中

，

胰岛素抵抗是重要的一环,

近年来的研究发现，

引起

NAFLD

的因素有超

胰岛素抵抗使脂肪组织中的脂解失调,过多的脂肪酸

重

、

胰岛素抵抗

、

缺少运动

、

高脂高糖的饮食模

被输送到肝脏

，

从而导致肝脏脂肪变性的发生间

。

(2)

式

、

遗传因素和肠道菌群失调叫图

1)

。

NAFLD

的主

脂肪酸的从头合成

。

机体大量摄入果糖和葡萄糖

，

会

要特征是肝脏内脂质异常积聚

，

在没有发生炎症和

增加肝脏脂质的从头合成

。

研究表明

，

人类肠道上皮

肝损伤的情况下

，

被称为脂肪变性或单纯性脂肪肝

。

对果糖的吸收能力有限,所以大部分果糖都在肝脏内

NAFLD

包括单纯性脂肪肝

、

非酒精性脂肪肝炎及非

被磷酸化形成脂肪酸

，

这一磷酸化的过程导致机体肝

酒精性脂肪肝炎引起的肝硬化

。

目前

,

NAFLD

的发

脏内

ATP

的耗竭

，

从而增加细胞应激反应

病机理尚不清楚

，

被提到最多的

“

二次打击

”

学说⑷是

IOANNOU

等冈研究发现

，

脂质在枯否氏细胞中

Blood-free

Inflammation

fatty

acids

Insulin

resistance

Dietary

lipids

Dietary

sugars

图

1

NAFLD

的发病机制(根据参考文献

[6]

修改)

Fig.l

The

pathogenesis

of

NAFLD

(modified

from

reference

[6])

2258

•综述.

图

2

AFLD

的发病机制(根据参考文献

[17]

修改)

Fig.2

The

pathogenesis

of

AFLD

(modified

from

reference

[17])

堆积可以促进炎症因子白细胞介素

-1

卩

、

肿瘤坏死

因子

-a(tumor

necrosis

factor-a,

TNF-a)

释放

，

导致肝

酒精的代谢主要是在肝脏内进行的

，

通过乙醇

脱氢酶将乙醇转化为对人体毒性较大的乙醛

，

再由

细胞发生炎症反应

。

炎症还能干扰胰岛素信号

，

从

而引起胰岛素抵抗切

。

过多的脂肪酸在细胞内的堆

积

，

可以破坏线粒体膜的流动性

，

导致内质网应激和

乙醛脱氢酶转化为相对无毒性的乙酸

，

进入三竣酸

循环代谢为二氧化碳和水酒精诱导

AFLD

可通

过以下两个途径

：

(1)

酒精在肝脏中氧化产生

ROS,

线粒体功能障碍

，

后者会使得活性氧产生过量

，

最终

导致细胞炎症和凋亡的发生

，

形成

NASH

[101

o

固醇

调节元件结合蛋白

(sterol

regulatory

element

binding

ROS

可以促进脂质过氧化

，

改变磷脂膜通透性导致

肝脏氧化应激损伤

，

引起肝硬化等疾病发生

。

(2)

酒

精在肝脏中初步代谢产生乙醛

，

乙醛的毒性较大

，

可

促进

AFLD

的发展

，

乙醛可直接破坏

PPAR-a

的功能,

protein,

SREBP)

调控肝脏和其他组织胆固醇

、

脂肪

酸和甘油三酯

(triglyceride,

TG)

的合成

，

下调

SREBP-

使得游离脂肪酸无法被氧化

、

运输和输出

，

导致肝

lc

的表达可能对治疗脂肪性肝炎有益

。

过氧化物酶

体增殖物激活受体

(peroxisome

proliferators

activated

脏内的脂肪酸大量积累

，

破坏脂质稳态时

。

乙醛还

能损伤线粒体

，

抑制三竣酸循环

，

并可损伤肝脏微管

进而影响脂质代谢

，

使脂质沉积在肝细胞中

，

发展为

receptors,

PPARs)

负责调控能量平衡和脂质代谢

，

可

以将脂肪酸和碳水化合物从肝脏转移到脂肪组织,

增强脂肪细胞的脂肪储存

，

减少肝脏的负担肠

脂肪肝切

。

另外

，

最近的研究发现

，

乙醇可以通过抑

制胰岛素分泌而上调饥饿素的水平

，

从而使肝脏组

道菌群失调会降低胆碱水平

，提高甲胺水平,从而增

加脂蛋白脂肪酶活性

，

增加

TG

积累

，

促进

NASHZ

。

织中的脂质增加问

。

研究发现,

AFLD

与

Toll

样受体

4(Toll-like

recep-

1.2

AFLD

的发病机制

tor4,TLR4)

的关系密切

。饮用过量酒精会增加肠道

的通透性

，

并使细菌产生的脂多糖从肠道转移到肝

AFLD

的主要致病因素包括饮酒

、

肥胖

、

性别

、

和遗传等

。

参与乙醇代谢的酶活性在不同个体间有

脏

，

激活枯否氏细胞

，

通过脂多糖

/TLR4

通路

，

上调

基因决定的差异

，

不同的人代谢酒精的能力有强弱

核因子

-

k

B

表达

，

促进

TNF-a

分泌旧

。

LIN

等⑷发现,

敲除

77

4*

基因可以使天门冬氨酸氨基转移酶

(aspar

­

之分

，

女性的首过代谢和胃内的乙醇脱氢酶活性较

低

，

使患病几率增大测

。

肥胖则加重了肝脂质氧化,

tate

aminotransferase,

AST)

的水平显著降低，

TG

含量

显著降低

，

内源性脂肪生成基因的表达减少，

脂肪酸

加速了酒精性肝病的纤维化和肝硬化进程网(图

2)

。

冯秋琪等

：

脂肪肝细胞模型的研究进展

2259

氧化相关基因的表达增加

，

这提示敲除

77

4*

以改善酒精性肝损伤和脂肪肝

。

基因可

REITH

[211

提出两步胶原酶灌注技术分离人原代肝细

胞

，

第一步灌注是为了清除肝脏组织中残留的血液,

并加热组织

，

促使钙离子和乙二醇双四乙酸的消耗,

2

用于研究脂肪肝的细胞模型

肝细胞可分为两大类

。

肝实质细胞即正常肝细

胞和胆管细胞

，

分别占肝细胞总数的

70%

和

3%

〜

5%,

松动细胞与细胞之间的连接

；

第二步是使用胶原酶

灌注

，

将组织块消化成单个细胞

，

离心细胞可以将肝

细胞与非实质细胞分离

。

WANNINGER

等㈤用油酸

构成了肝脏的主要基质

；

非实质细胞主要包括内

(oleic

acid,

0A)

和棕扌闾酸

(palmic

acid,

PA)

诱导人原

代肝细胞的模型显示

，

细胞内的脂质显著增加

，

并与

皮细胞

、

枯否细胞和星状细胞

，

约占肝细胞总数的

25%

。

现有的模型细胞可以分为

：

人原代肝细胞

、

动物原代肝细胞

、

永生细胞系

、

诱导多能干细胞

OA

和

PA

存在剂量依赖效应

，

脂质积累导致

TGF-0

上

调

，

而

TGF-p

可能促进肝纤维化

。

(induced

pluripotent

stem

cells,

iPSCs)

源性肝细胞样

细胞

(hepatocyte-like

cells,

HLCs)

和肝切片(表

1);

培

养形式可分为单独培养

、

共培养和三维培养(表

2)

。

由于不同捐献者的个体差异和细胞分离过程

中的各种因素的影响

，

可能出现实验结果不稳定

、

重复性差的情况

。

此外

，

人原代肝细胞的培养条件

2.1

建立细胞模型所用的细胞系

比较苛刻

，

只能在短期内培养

，

不能无限传代

，

不利

2.1.1

人原代肝细胞

人原代肝细胞在较大程度

上保留了细胞在体内器官里的功能

，

各种物质代谢

功能和酶活性与体内的肝细胞极其相似

，

是最为接

于实验开展

。

人肝样本的稀缺和伦理道德问题也阻

碍了人原代肝细胞的广泛应用

。

2.1.2

动物原代肝细胞

鉴于人原代肝细胞存在

数量稀缺和伦理道德等问题

，

研究人员尝试从动物

近临床的一种标准体外短期培养模型

。

人原代肝

细胞通常从肝或肝组织中获得

，

一般在肝切除手术

肝脏中分离原代肝细胞

，

用来体外培养并进行研究

。

使用较多的是啮齿动物,还有一些哺乳动物和鱼类

。

中或者肝移植后排斥的肝组织中获取

，

随后即时

进行研究或者冻存待用

。

早在

1976

年

，

SEGLEN

和

贾哲等剛以改进的两步灌流法分离培养的奶

表

1

不同细胞系的优势与不足

Table

1

Advantages

and

disadvantages

of different

cell

lines

模型种类

Model

types

细胞系

Cell

lines

优势

Advantages

不足

Disadvantages

Primary

cell

cultures

of

human

Hepatocytes

isolated

from

Mimic

in

vivo

settings

Isolation

problems,

ethical

issues,

varying

repro-

NAFLD

patients

ducibility

in

experiments,

limited

culture

time

Mimic

in

vivo

settings

Varying

reproducibility

in

experiments,

limited

culture

time

Primary

cell

cultures

of

animals

Immortalized

cell

lines

Hepatocytes

isolated

from

NAFLD

animals

HepG2,

L02,

HuH7,

HepaRG

Continuous

growth,

easy

to

culture,

stable

Expression

of

several

enzymes

alter

according

to

the

immortalization

method

phenotype

Wide

source,

large

number,

stable

pheno-

Hepatocyte-like

cells

Not

applicable

Risk

of

tumorigenesis,

and

the

acquisition

pro-

type

and

high

similarity

with

hepatocytes

cess

is

complicated

Precision-cut

liverNot

applicable

Contains

a

variety

of

liver

cells

that

mimic

Short

survival

time

in

vitro

slices

liver

tissue

表

2

不同的细胞培养方式的优势和不足

Table

2

Advantages

and

disadvantages

of

different

methods

of

cell

culture

培养方式

Culture

methods

优势

Advantages

不足

Disadvantages

Single

cell

type

and

lack

of

dimension

Monoculture

Short

cycle

and

high

efficiency

are

beneficial

to

high-throughput

drug

screening

experiment

Coculture

Mimic

in

vivo

liver

architecture,

important

tools

in

cellular

cross

talk

studies

Difficult

to

cultivate

3D

culture

Mimic

in

vivo

liver

architecture,

liver

specific

differentiation

and

function,

tools

for

transcriptional

regulation

studies

Difficult

to

cultivate,

expensive

2260

牛肝细胞为研究对象

，

使用

0

〜

1

mmol/L

的油酸钠对

其诱导处理

12

h,

根据细胞活性和脂滴大小最后选

择了

0.25

mmol/L

作为最佳诱导浓度

。

结果显示

：

处

理过的细胞在电镜下被观察到线粒体空泡化严重,

糖原颗粒较少

，

符合临床脂肪肝病理现象

;

PPAR-a

的基因表达水平较对照组显著升高

，

脂质合成基因

SREBP-lc

和

CA/?£5P(carbohydrate-responsive

ele

­

ment-binding

protein)

的表达水平显著降低

。

ZHENG

等网使用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞,

体外培养一定时间后

，

用浓度为

0.2

mmol/L

的

PA

诱

导

24

h,

模型组细胞与对照组相比

，

细胞内脂质显著

增多

，

细胞摄取葡萄糖的能力显著降低

，

促炎细胞因

子白细胞介素

-6

、

白细胞介素

-1B

和

TNF-a

的分泌显

著增多

，

使用益母草三帖酸干预后

，

通过调控

PI3K/

Akt/GSK3p

通路减轻了细胞胰岛素抵抗

。

动物原代细胞解决了人原代肝细胞伦理问题

和数量有限的问题

，

缺点是受到动物来源和批次不

同的影响

，

重复性差,并且较为敏感

，

培养条件苛刻

。

2.1.3

永生细胞系

永生细胞系能够无限传代

，

通

常使用的永生化手段是在人原代肝细胞中过表达

病毒致癌基因和(或)人端粒酶逆转录蛋白基因

。

永

生细胞系与原代肝细胞相比

，

具有以下优点

：

生长

稳定

、

无限寿命

、

表型稳定

，

并且培养条件比原代

肝细胞简单

，

易于在不同实验室间标准化

。

常用的

永生细胞系有人肝癌细胞系

HepG2

、

人正常肝细胞

L02

、

人肝癌细胞系

HuH7

、

人肝癌细胞系

HepaRG

和人肝星状细胞系

LX2

等

。

YIN

等⑷使用脂肪酸诱导

HepG2

细胞

24

h

后

，

通

过油红

O

染色观察细胞内脂质积累显著增多

，

TG

、

乳酸脱氢酶

(lactate

dehydrogenase,

LDH)

和丙二醛

(malondialdehyde,

MDA)

含量显著增多

，

提示细胞

出现损伤和脂质过氧化

；

超氧化物歧化酶和谷胱甘

肽显著减少

，

提示抗氧化性减弱

。

赵爽等⑷使用

3%

的乙醇诱导

L02

细胞

48

h,

AST

、

ALT(alanine

ami

­

notransferase)

显著上升

、

TG

含量和

ROS

水平显著上

升

，

证明细胞获得了脂肪肝和氧化应激的特性

。

喻

青青等

［

27

］

使用

0.5

mmol/L

的

OA

诱导

HepG2

细胞

24

h

后,

TG

和

ROS

显著增多

，

细胞摄取葡萄糖的能力显著

下降

，

表明细胞出现脂变性

、

氧化应激和胰岛素抵

抗的症状

。

KHAMPHAYA

等曲使用

PA

诱导

HuH7

细

胞

24

h,

细胞出现脂肪变性

。

MICHAUT

等固使用

OA

诱导

HepaRG

细胞

1

周后出现脂肪变性

。

BARBERO-

.综述.

BECERRA

等㈣将

HuH7

和

LX2

共培养

，

使用

PA

和

OA

诱导

24

h

后，

肝细胞和肝星状细胞都出现脂肪变性,

并且肝星状细胞被激活

。

病毒致癌基因介导的永生细胞系存在致瘤和

病毒感染的风险

；

过表达人端粒酶逆转录蛋白基因

这种方法只适用于人类胎肝细胞和新生肝细胞

，

无

法诱导成人肝细胞永生化

。另外

，

永生化可能使细

胞的染色体损伤,从而导致细胞失去相应的功能的

。

2.1.4

诱导多能干细胞源性肝细胞样细胞

诱导

多能干细胞可以分化成各种体细胞

，

不会产生免疫

排斥和伦理问题

。

人

iPSCs

分化而来的

HLCs,

其形

态与功能特性可以与原代肝细胞相媲美

，

并且有来

源广

、

培养数量大

、

表型稳定等优点

，

弥补了原代

肝细胞的不足阳

。

GRAFFMANN

等㈣诱导人

iPSC

分化为

HLCs,

在

细胞分化至第

12

天时

，

细胞各项指标均符合肝细胞

的特征

。

加入

50

mmol/L

的

OA

诱导

48

h

后

，

细胞内

脂质积累增多

,

PLIN2

表达量增加

，

表明细胞获得

NAFLD

。

PARAFATI

等网将多能干细胞分化成

HLCs

后

，

使用浓度为

25

ymol/L

的

OA,

协同浓度为

50

pmol/L

、

100

jxmoI/L

和

200

gmol/L

的

PA

分别诱导

18

h,

用硼-

二毗咯甲基染色

，

观察到脂滴的数量随着

PA

浓度升

高而增多

。

已知

TG

可以诱导细胞内质网应激

，

随后

用

TG

联合脂肪酸诱导细胞来验证内质网应激是否

能增加外源性脂肪酸在细胞内的积累

，

结果显示

，

内

质网应激可以显著增加细胞内的脂质积累

。

然而

，

诱导多能肝细胞技术尚存在问题

，

如诱

导细胞转化的效率低

，

在诱导过程中可能发生基因

变异,具有致瘤风险

，

这些缺点限制了其广泛应用

。

2.1.5

精密肝切片

精密肝切片是介于器官与细

胞水平之间的体外培养技术

，

相比细胞模型

，

肝切片

更接近复杂的人体肝脏结构和组成

。

肝切片中包含

肝细胞

、

枯否氏细胞和肝星状细胞等

，

创造了多细

胞的环境

，

各类肝细胞互相作用能更好地模拟肝脏

组织环境

，

但它的缺点是存活时间较短

，

不能长期培

养

。

精密肝切片的制作方法是在低温无菌环境下,

先切下直径为

9

mm

左右的圆柱形的实验动物的肝

脏组织

，

然后将肝脏组织放入缓冲液

，

用组织切片机

切成

200-500

pm

的薄片

，

切片太厚会影响组织通透

性

，

不利于氧气和营养物质的扩散

；切片太薄则损伤

细胞比例过大

，

影响实验结果

。

切片前用低温的缓

冲液对肝组织清洗

，

也可以将切片置于缓冲液中

，

低

冯秋琪等

：

脂肪肝细胞模型的研究进展

温保存

1

h

后再培养

，

这样的细胞活力较高

。

切片的

培养系统主要有两种

：

动态组织培养系统和持续浸

润组织培养系统

。

前者在闪烁瓶中间歇通入

02

和

C02,

在

37

°C

下振荡水浴;后者是在多孔板中持续通

入

02

和

C02,

在

37

弋下振荡水浴

。

两种培养系统在

短时间内无明显差别

，

多孔板由于价格低廉而被更

多地使用厲】

。

SCHAFFERT

等

【

旳建立了一种

AFLD

肝切片模型,

在培养基中加入

25

mmol/L

的乙醇培养

24

h

后

，

模型

细胞内的谷胱甘肽消耗量显著增加

，

脂质过氧化作

用增强

，

白细胞介素

-6

显著增加

。

培养

48

h

后

，

平滑

肌肌动蛋白和胶原蛋白

la

显著增多

，

提示肝纤维化

加剧

，

因此

，

该模型可用来研究

AFLD

和酒精性肝损

伤

。

PRINS

等㈤建立了一种大鼠的精密肝切片模型

模拟代谢综合征

，

厚度为

250

〜

300

pm,

在培养基中

分别加入浓度为的

25

mmol/L

葡萄糖

、

5

mmol/L

果

糖

、

1

nmol/L

胰岛素和

240

pmol/L

的

PA,

孵育

24

h

后

，

油红

O

染色和试剂盒检测显示

：

无论有没有

PA

存

在

，

葡萄糖

、

果糖和胰岛素共同孵育后脂滴都明显

增多

，

乙酰辅酶

a

竣化酶

1

、

乙酰辅酶

a

竣化酶

2

以及

SREBP-lc

的上调提示肝细胞中脂肪从头生成增加

。

此外

，

肉碱棕柵酰转移酶

1

表达降低

，

提示脂肪酸转

运受损

，

线粒体

B

氧化紊乱

。

这一新的体外

NAFLD

模型成功地诱导了脂肪变性

。

2.2

细胞培养的方式

2.2.1

单独培养模型

单独培养是指一种类型的

细胞贴壁培养

，

这是最基础的一种培养方式,无论是

原代细胞

、

永生系细胞都可以进行单独培养

。

单独

培养技术的优点是周期短

、

效率高

，

有利于高通量

药物筛选实验

，

所以普遍应用于脂肪肝的研究

。

RAFIEI

等悶用

NAFLD

细胞模型评价了几种多酚

类物质和生物碱小漿碱对

NAFLD

的作用

。在模型中

使用浓度为

1.5

mmol/L

的

OA

诱导

HepG2

细胞

24

h,

引

起脂肪变性和细胞形态变化

，

随后用多酚类物质干

预

NAFLD

细胞

，

检测了脂代谢相关的基因表达情

况

，

结果表明

，

多酚类物质可以显著改善

NAFLD

。

MONTESAN

0

等列在研究左旋肉碱对脂肪肝的作

用时

，

利用

5

mmol/L

的果糖诱导

HepG2

细胞

48

h

建立

NAFLD

模型

，

结果表明

，

左旋肉碱可以明显减少细

胞内脂质

，

改善氧化应激

。

单独培养模型由于相对简单

，

在研究中应用较

多

，

但它们缺乏维度

，

没有介质流

，只有一种类型的

2261

细胞,缺少其他类型的细胞

，

如枯否氏细胞

、

星状细

胞和巨噬细胞等,缺乏细胞之间的相互作用

。

2.2.2

共培养模型

共培养模型可以弥补单独培

养模型的缺陷

，

在模型中引入第二种细胞

，

增加了细

胞之间的相互作用

，

可以更好地模拟肝脏的生理机

能

。

人原代肝细胞与内皮细胞共培养可支持肝细

胞维持其表型形态

，

改善其特定功能

，

并可形成毛细

血管样结构

，

更有利于模拟体内环境

，

研究脂肪肝病

的病理机制阙

。

枯否氏细胞是位于肝血窦的一种巨

噬细胞

，

可以分泌炎性细胞因子

。

人原代肝细胞和

枯否氏细胞的共培养可以评估促炎环境下的肝细胞

反应叩

。

GIRAUDI

等说

1

将人肝细胞

HuH7

和肝星状

细胞

LX2

共同培养

，

用脂肪酸诱导

24

h

后

，

细胞内脂

质的积累增多

，

a

平滑肌肌动蛋白表达增多

，

提示肝

星状细胞被活化

，

细胞出现脂肪变性与纤维化的表

征

。

在另一个研究中

，

将人原代肝细胞

、

肝星状细

胞和枯否氏细胞三者共同培养

，

用脂肪酸

、

葡萄糖

、

胰岛素和炎症细胞因子刺激细胞

，

模拟非酒精性脂

肪肝炎

，

该模型细胞内的脂肪从头合成作用增强

，

细

胞出现氧化应激

、

炎症

、

纤维化症状以及肝星状细

胞的激活阿

。

CHEN

等网建立了一种

HepG2

细胞与

THP-1

巨噬细胞共培养的模型

，

先将巨噬细胞贴壁于

无菌载玻片，

随后将载玻片放入接种了

HepG2

细胞的

6

孔板中

，

加入浓度为

1

mmol/L

的混合脂肪酸

（

PA

和

OA

的比例为

1

：

2

）

,

诱导

24

h

后建立了

NAFLD

模型

。

共培养模型的优点是弥补了单独培养模型的

不足

，

培养条件简单

，

还能进行高通量实验

。

但是现

有的共培养模型种类不多

，

未来还有很大的发展潜

力

。

2.2.3

三维培养模型

环境对细胞的生存至关重

要

，

在活体肝组织内

，

肝细胞与细胞外基质之间有物

质传输和信号传递

，

细胞外基质还起到支撑三维结

构的作用跑

。

在传统的二维系统中培养较长时间的

人原代肝细胞由于上皮-间质转化发生了形态学改

变

，

从而导致肝细胞极性和相关肝功能的丧失跑

。

三维培养常用的方法有支架培养和悬浮培养

这两种

。

常用的支架材料有水凝胶

、

胶原蛋白和层

黏连蛋白等

，

支架可以支撑肝细胞

，

形成类似细胞间

接触和细胞间基质的相互作用

。

悬浮培养是指细胞

在悬浮条件下自发聚集形成球体

，

这种方法操作简

单

、

费用低

、

应用广泛

【

切

。

三维培养还分为三维单

2262

细胞培养和三维共培养

，

下文是对两者的说明

。

（

1

）

三维单独培养模型

。

在

GEVAERT

等的的实

验中

，

水凝胶支架包裹的人原代肝细胞聚集物培养

21

天后仍保持稳定的肝细胞表型

。在另一个实验中

，

生

物打印机根据特定的类似肝脏结构的设计模板

，

将

细胞聚集物与支撑结构

（

通常是水凝胶

）

同时聚积刚

。

KOSTRZWSKI

等呦建立了一种三维的人原代肝细

胞模型

，

模型组含有

0.6

mmol/L

的脂肪酸

，

对照组和

模型组都添加了适宜浓度的胰岛素和葡萄糖

。

培

养

7

天后

，

模型组脂质积累明显增多

，

14

天后进一步

增加

，

模型组消耗的脂肪酸是对照组的

4

倍多

。

造

模后细胞的

AST

、

ALT

泄漏量无显著变化

，

表明细

胞活性正常

，

不受造模液影响

。

细胞内谷胱甘肽水

平

、

LDH

释放

、

尿素生成和线粒体活动也不受造模

液的影响

，

证明此三维模型的细胞功能齐全

。

基因

CYP2EK

IGFBI

、

PDK4

和

CYP7A1

的表达量都显著

升高

，

表明模型具有脂肪变性特征

。

此模型检测二

甲双孤等抗脂肪肝药的效果显著

。

三维模型能更好地模拟体内环境

，

培养时间更

长

，

有利于进行反复诱导实验

。

球体三维模型可用

于高通量筛选实验

，

效率较高

。

缺点是建立三维模

型非常耗时并且昂贵

，

由于其仍处于早期使用阶段,

有些功能还有待验证

。

（

2

）

三维共培养模型

。

三维共培养模型可用于

研究更复杂的脂肪肝表型

，

如炎症和肝纤维化

。在

三维共培养模型中

，

人肝细胞与非实质细胞一起培

养

，

可以在三维空间模拟肝内各种类型细胞之间的

相互作用

。

三维共培养模型的优点是能长期维持重

要的代谢功能

，

并在相关条件下诱导脂肪肝病理表

型

。

SUMANTA

等

〔

旳使用瑞士

InSphero

品牌的三维

人肝微组织系统

，

将原代人肝细胞与肝星状细胞

、

枯否氏细胞和内皮细胞共培养

，

使用

PA

诱导细胞,

成功建立了脂肪肝模型

。

模型显示

，

PA

显著增加

了炎症因子以及促纤维化基因的表达

（

包括胶原基

因

、

a-

平滑肌肌动蛋白

、

金属蛋白酶组织抑制因子

1

、

血小板衍生生长因子受体中以及白细胞介素

-8

）

,

造成肝微组织的损伤

。

还检测到转化生长因子

B

通路被激活

，

使用

GS-4997

（

—

种凋亡信号调节激酶

ASK-1

的抑制剂

）

进一步验证该模型

，

结果显示

，

GS-

4997

显著降低了

PA

诱导的炎症和纤维化反应

，

同时

降低了细胞凋亡和肝星状细胞的活化

。

.综述.

三维共培养模型的缺点是操作复杂和价格昂

贵，

还需要继续提升技术和完善功能

，

从而在科研中

得到更广泛的利用

。

脂肪肝细胞模型所用的细胞类型多种多样

，

培

养的方法也各不相同

。

每种细胞模型都有自身的优

缺点

，

研究者可根据实验环境

、

研究目的等因素选

择适当的细胞模型对脂肪肝进行研究

。

3

脂肪肝细胞模型的干预条件

3.1

高脂诱导脂肪肝

医用脂肪乳剂毒性低

、

溶解性好

、

操作简便

、

经济实惠

。

刘晓等阿使用

HepG2

细胞建立了一种

NAFLD

模型

，

脂肪乳剂的质量浓度为

0.2%~4.0%,

孵

育

72

h

后

，

用

MTT

法检测细胞活性

，

油红

0

染色细胞

内脂质

，试剂盒法检测细胞内

TG

。

结果显示

，

1%

及

以下浓度的脂肪乳剂对细胞活力无影响

，

0.4%

及以

上浓度的脂肪乳剂可以逐渐增加细胞内脂滴

，

1%

为

诱导的最佳质量浓度

，

此时胞内

TG

最多

，

且细胞存

活率最咼

。

PCR

结果显不

，

1%

脂肪乳剂孵育

24

h

后,

模型组细胞肉碱棕稠酰转移酶

1

和

TNF-a

表达量显

著增多

，

SREBP-lc

表达量显著降低

，

提示

NAFLD

和

炎症反应的发生

。

PA

和

OA

是人体中最丰富的膳食长链脂肪酸

，

是

目前

NAFLD

造模中最常用的脂肪酸

，

但是脂肪酸存

在溶解性差的问题

。

为了使其更好地溶解于培养基,

YASUYUKI

等使脂肪酸与

BSA

以

5

：

1

的比例结合,

溶解后再用培养基稀释至所需浓度

。

CHEN

等列利

用

500

憾

/

mL

的

OA

诱导

WRL68

细胞

24

、

48

h,

建立了

脂肪肝模型

。

GOMEZ

等㈤的实验表明

，

PA

与

OA

浓

度比为

1:2

时对肝细胞毒性最小，

所以很多研究采用

此比例

。

CHIENWICHAI

等

3

）

利用

0.2

mmol/L

的

OA

和

0.1

mmol/L

的

PA

共同诱导

HepG2

细胞

72

h,

成功建

立了脂肪肝模型

。

肖晴等㈤使用

1

mmol/L

的游离脂

肪酸

（

OA

：

PA=2

：

1

）

诱导

HepG2

和

L02

细胞

24

h

均获得

了脂肪肝细胞模型

。

3.2

高糖诱导脂肪肝

有研究证明

，

高果糖摄入与

NAFLD

和肝纤维

化相关网

。

贺雯茜等列建立了果糖诱导的

L02

细胞

脂肪肝模型

，

并检测到果糖浓度在

32

mmol/L

以下时

对细胞活性无影响

，

果糖浓度不低于

4

mmol/L

时能

显著增加细胞内脂质

，

并上调乙酰辅酶

a

竣化酶

1

、

SREBP-1

和碳水化合物反应元件结合蛋白的表达

。

冯秋琪等

：

脂肪肝细胞模型的研究进展

ZHAO

等佝为了研究果糖和脂肪酸的造模效

果

，

使用

5

〜

25

mmol/L

葡萄糖和

/

或

5

〜

25

mmol/L

果糖

在

1

mmol/L

混合脂肪酸

（

PA

和

OA

浓度比为

1

：

2

）

存在

的条件下诱导

HepG2

细胞

24

h,

监测脂质和尿酸生

成

、

葡萄糖代谢

、

氧化状态以及相关基因和蛋白的

变化

。

结果表明

，

PA

可以诱导胰岛素抵抗

、

氧化应

激和脂质积累

，

OA

促进细胞内脂质积累

，

而果糖可

以促进尿酸和胆固醇的产生

，

果糖

、

葡萄糖和脂肪

酸协同提高细胞内外

TG

和细胞外的

MDA

。

3.3

酒精诱导脂肪肝

肝脏是储存铁的主要部位

，

机体出现

AFLD

时,

肝铁含量增多

，

铁会促进肝细胞的脂质氧化

，

从而损

害肝细胞的

。

袁叶飞等阿使用含有

0.5%

乙醇和

0.01%

硫酸亚铁的培养液诱导

L02

细胞

，

培养

3

天后再换不

含乙醇和硫酸亚铁的培养液培养

3

天，

重复

3

次

，

获得

了

AFLD

细胞模型

，

乙醇和硫酸亚铁诱导后胞内

TG

含量显著上升

，

脂质积累增多

，

但是

AST

、

ALT

没有

显著性变化

，说明低浓度的酒精对细胞活性没有显

著影响

。

班笃敬等阿在研究木香桂内酯对

AFLD

的影响

时

，

利用浓度为

100

mmol/L

的酒精诱导

L02

细胞

48

h

后,检测到细胞内的

TG

、

TC

含量显著增多

，

形成脂肪

肝

。

魏颖等刚为了探究玉米肽和姜黄素对

AFLD

的作

用时

，

在

HepG2

细胞培养基中加入浓度为

1

mmol/L

的

OA

、

玉米肽和姜黄素共同培养

20

h

后

，

加入

0.6%

的

无水乙醇继续培养

4

h,

建立了

AFLD

的细胞模型

，

检

测到模型组细胞的

ALT

、

AST

和

LDH

泄漏量显著增

多

，

提示发生细胞损伤

；

胞内

TG

、

MDA

和乙醇脱氢

酶含量显著增多

，

提示细胞内脂质和脂质过氧化产

物增多

。

综上所述，

高脂

、

高糖和酒精都可以诱导细胞

脂肪变性

，

一般来说

，

浓度越高

，

作用时间越长

，

诱

导脂肪肝的效果越好

，

但是酒精浓度过高会影响细

胞存活率

。

不同的细胞系对糖类

、

脂类

、

酒精的

敏感性也有所不同

，

研究者需要预先筛选岀适当的

造模液浓度

。

NAFLD

的检测指标有

TG

、

TC

、

糖

原

、

ROS

水平

、

炎症因子

。

AFLD

的检测指标有

TG

、

TC

、

ROS

、

AST

、

ALT

、

MDA

、

乙醇脱氢酶等

。

4

结语与展望

如本文所述

，

细胞模型可以反映

NAFLD

的发病

机制

，

并作为一种工具来测试新的治疗手段和预防

2263

策略

。

目前的脂肪肝细胞模型种类很多

，

其中二维

培养的原代细胞和永生细胞系被广泛应用

，

随着科

技发展

，

细胞模型也变得越来越复杂和精密

，

如三维

培养和共培养模型

，

肝切片技术也随着技术发展得

到了提高

。

高脂

、

高糖

、

酒精均能诱导细胞形成脂

肪肝

。

细胞模型具有数量大

、

周期短

、

易于重复的

优点

，

是研究脂肪肝发病机制的有力工具

，

可以与动

物模型互相补充

。

未来的目标应该是发展和完善标

准化的细胞模型

，

探究

NAFLD

发展的分子机制

，

为

治疗脂肪肝提供更好的理论基础

。

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