蛋白质银染原理与方法

原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是 2～／蛋白条带。

① SDS-PAGE电泳。注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与Commassie

Blue染色比较，银染加样量要少。否则难以得到清晰的电泳分辨率。

② 电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。加入25ml Fixing

Solution（固定液），室温振荡保温30min。胶需要完全淹没在固定液中。

③ 彻底弃去固定液，加入25ml

Incubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。胶需要完全淹没在保育液中。

④ 彻底弃去Incubation

Solution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。

⑤ 准备：取 10X

Silvering Solution, 加入水，混匀后使用。

⑥ 弃去洗涤的水，加入25ml

Silvering Solution (银染液)。室温振荡保温20min。

⑦ 彻底弃去银染液，加入25mL

Developing

Solution（显色液），室温振荡保温1~10min。注意观察目的条带。如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。显色时间不要过长，否则本底较深。

⑧ 彻底弃去显色液,

加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。

⑨ 彻底弃去Stopping

Solution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。

弃去洗涤的水，加入25mL Preserving

Solution（保护液），室温振荡保温20min。银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。

今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？

hotstoe wrote:

1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.

2. % 硝酸银染色10分钟.

3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.

4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.

显色液配方: 10克氢氧化钠+克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.

这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.

我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，

硝酸银染色10分钟.

3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）

4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越

高可能导致背景就深，

5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，

6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。

多谢各位的指导!

我现在是在12%的凝胶里加入丙三醇优化.

现在的问题是背景和条带都很浅.仍能分辨读出条带数,但是拍摄出来的还是不清楚.

请问有必要提高硝酸银的浓度吗?(我现在用的是%的硝酸银)

向各位请教几个关于TRAP-银染的问题，多谢各位指教。我用的是鼎国的试剂盒做的TRAP，用的是8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后是银染，但是结果很令人失望，电泳的胶取下来的时候竟然破成了好几片，染色后也看不出什么结果，我想问的是TRAP-银染，这个实验成功的关键步骤在哪里，哪一步最容易出问题？银染后理想的结果应该是什么样子的？请说的具体点好吗，谢谢。背景是什么样的比较好，还有条带应该是什么颜色，有多深，什么样的。谢谢了！

我的做法是这样的，染色效果还可以

10%的乙醇固定10分钟，ddH2O洗一次， 2分钟。

1%的硝酸脱色4分钟，ddH2O洗两次，每次1分钟。

%AgNO3染色20分钟，ddH2O洗三次，每次1分钟。

NaCO3-甲醛显色至条带出现。

我的感觉是乙醇和硝酸重复使用的次数不要太多，这样效果不好，NaCO3-甲醛得质量很关键，我们有一次换了试剂，效果非常差。

1) 10%乙醇，5 min；

2)双蒸水过水2次（短暂）；

3)1%硝酸，5min；

4)双蒸水过水；

5)%硝酸银，在摇床摇动10 min；

6)双蒸水过水（不超过5sec）；

7)显影液显影，边晃动边显影，至显影满意为止；

8)10%冰乙酸固定，至无气泡；

9)40℃烘箱，3天；

10)剥离，保存。

Notes:显影液的配制：

无水碳酸钠

甲醛 100ul

硫代硫酸钠（1%） 10ul

双蒸水 100ml

银染法分以下几个程序：

1、固定

2、敏化

3、银育

4、显影

5、停显

此外，其间还有数步的漂洗程序。

在你的银染方法中没有敏化过程，不过也中可以的，只是灵敏度会下降。

银染法还可分为碱性银染和酸性银染法，你的方法为酸性银染法。

为何称为酸法？是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名？

何为二胺类银染法？俺知道有银铵法，即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠，银离子在氢氧化钠的作用下生成氢氧化银沉淀，后加入过量氨水，形成可溶的银铵络和物，而后者经甲醛还原为单质银颗粒。二胺法可是指此络和物为二铵盐？您这里的“胺”应为“铵”。

至于敏化作用，众说纷纭，且银染的灵敏度相当高，对常规分子生物学实验已是牛刀小用，敏化俺认为还是不用的好，因为对背景不利。

对于银染的研究在80年代的electrophoresis杂志中多有报道。

小经验：为便于控制显影速度，得到最佳的信噪比，银染的显影液温度不要过高，以10度左右为宜，高则易显影过度，背景深，低则显影时间长。

考染后银染我做过不少次，银染的效果还是不错的。无需把考染的蛋白条带全部脱色，只要本底脱差不多就可以了。银染的固定步骤也可以省略，因为在考染前已经固定过了。只需要用％乙酸钠+%戊二醛＋30％乙醇＋％硫代硫酸钠浸泡30min，去离子水清洗3次，每次5min，％硝酸银染色20min，去离子水清洗膜两面，就可以用碳酸钠＋甲醛的显色液显色了，直到自己满意为止，再用5％乙酸终止显色。效果还是很好的。

1,--原理： 蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是 2～／蛋白条带。

2，材料及注意；

固定和脱色液

10％（／）戊二醛（用50％贮液现用现配，Kodak）

硝酸银溶液（含氨）

洗印显影液

Kodak快速定影液A

【注】全过程需穿戴手套，以免指纹污染。

3，步骤：

步骤：

l）将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器并以5倍体积的固定液覆盖，在旋转摇床中缓慢摇

动 30min以上。

2）倾去固定液，加 5倍凝胶体积的脱色液，缓慢摇动 60 min以上。

3）倾去脱色液，加 5倍凝胶体积的 10％戊二醛，在道凤橱中缓慢摇动 30min。

小心:带手套并仅在通风泅中进行。

4)倾去戊二醛溶液，用水洗凝胶4次以上，每次 30 min以上，最后一次洗涤以过夜为

佳。缓慢摇动。

5）倾去水，将凝胶置于约5倍凝胶体积的硝酸银榕液中平衡（完全盖没凝胶），剧烈振荡

15 mln。

小心：由于氨银溶液干燥会发主爆炸．应马上用大量水冲洗

6）将凝胶移至另一塑料盒，用去离子水洗5次。每次精确5min，缓慢摇动。

7）用500mL水稀释25mL显影液，将凝胶移至另一塑料盒，加人足够的稀释显影液盖

没凝胶，并剧烈摇动至条带达到需要的强度。如果显影液变成傣色。须换新鲜的显影

液。

8）换Kodak快速定影液，定影5 mln，必要时，用湿润了的棉花搽去凝胶表面沉积的残

余银沉积物。倾去定影液，用水彻底冲洗凝胶（4～5 min）。

9）凝胶拍照

这是我经常用的步骤，经过检验n次了，希望能帮助你。

蛋白银染步骤

步骤 溶液 时间

固定 甲醇 100ml

冰醋酸 25ml

加双蒸水至250ml 30min

冲洗 双蒸水 3次

敏化 甲醇 75ml

戊二醛（25%w/）

硫代硫酸钠(5%w/) 10ml

醋酸钠（17g）

加双蒸水至250ml 30min

冲洗 双蒸水 3次

银反应 硝酸银溶液%w/) 25ml

甲醛(37%w/)

加双蒸水至250ml 20min

冲洗 双蒸水 2次

显色 碳酸钠

甲醛(37%w/)

加双蒸水至250ml

2-5min

终止 EDTA-Na22H2O

加双蒸水至250ml 10min

冲洗 双蒸水 3次

我室固定的蛋白银染方法，效果很不错，也很简单，步骤如下：

1）PAGE胶切下后用50％乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟

2）2％硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒

3）2％硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒

4）6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗

5）加中止液10％乙酸中止即可

silia wrote:

我室固定的蛋白银染方法，效果很不错，也很简单，步骤如下：

1）PAGE胶切下后用50％乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟

2）2％硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒

3）2％硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒

4）6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗

5）加中止液10％乙酸中止即可

大家好，我看了此贴，有一点不太明白，

硫代乙醇酸钠，是什么药品，是不是作者写错啦？望大虾指点。急，盼复。另外，其后的洗20秒还是20分呀？

我推荐使用graymatter 的protocol,基本上和我们用的一致，应该很稳定的，其中稍稍有一些经验,如:

1. 固定这步是可以过夜的。

2. 加银染液后一定要避光！！

3. 在固定、银染这几步最好放在摇动托盘上！这样随着的液体的晃动作用比较均匀。

4. 显色这步很关键，需要一些摸索，新手经常会显过了，整个gel黑糊糊的！

5. 显色对光线没有太大要求，室内可见光就行。

6. 接触gel时有条件一定要带一次性手套，要不然可以染出来一个大手印的！

前面几位说的很好，而且看来非常富有经验

不过，咱也贡献一把吧，只是一点注意事项：

1，最好全部用去离子水，电阻>=18兆欧

2，如果想要充分显色，可以适当提高温度，比如37度温箱

3，最好戴手套处理全过程

ptotocol是这样的，请看哪里不妥：

蛋白银染步骤

步骤 溶液 时间

固定 甲醇 100ml

冰醋酸 25ml

加双蒸水至250ml 30min

冲洗 双蒸水 3次

敏化 甲醇 75ml

戊二醛（25%w/）

硫代硫酸钠(5%w/) 10ml

醋酸钠（17g）

加双蒸水至250ml 30min

冲洗 双蒸水 3次

银反应 硝酸银溶液%w/) 25ml

甲醛(37%w/)

加双蒸水至250ml 20min

冲洗 双蒸水 2次

显色 碳酸钠

甲醛(37%w/)

加双蒸水至250ml

2-5min

终止 EDTA-Na22H2O

加双蒸水至250ml 10min

冲洗 双蒸水 3次

建议使用silia的方法！！

简单，快！

本人的银染方法：

1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml %HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟；

2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；

3. 预处理：％ Na2S2O3 处理一分钟；

4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；

5. 染色： 20％AgNO3+72ml %HCHO处理PAGE胶20分钟；

6. 水洗：同上；

7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml %HCHO, 1ml ％ Na2S2O3, 漂洗10－15分钟；

8. 水洗：同上；

9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。

以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。

谢谢！！！

银染色

1 银染液1（1000ml） ： 甲醇50％ 乙酸12％

甲醇 500ml 冰醋酸 120ml

2 银染液2（1000ml）： 甲醇30％，乙酸钠，戊二醛%，硫代硫酸钠%， （含乙酸 1－2ml）

甲醇300ml 乙酸钠 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml

3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠% 甲醛 %

无水碳酸钠25g， 甲醛

4 硝酸银（100ml）： 20%硝酸银 （过滤后待用）

染色步骤：

1 银染液1 洗2次， 每次5分钟

2 银染液2 洗1次，每次30分钟

3 超纯水 洗2次， 每次1分钟

4 %硝酸银 洗30分钟

5 超纯水洗5次，每次1分钟 （关键步骤，共计5分钟）显色液显色

6 看到各条带，则倾去显色液, 1％ 乙酸中止

我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。但水洗不充分又可能导致背景较深。

我个人一般是用水洗三遍，每次半分钟左右。

固定液：50%乙醇，10%冰醋酸，40%水

浸泡液：30%乙醇，% NaAc，50%戊二醛 ，% NaS2O3•5H2O

银染液：% AgNO3，% 甲醛

显色液：% Na2CO3，% 甲醛

终止液：% EDTA-2Na•2H2O

银染方法：参照phamacia 公司提供的银染方法。

凝胶－固定液30分钟－浸泡液30分中－水洗5分钟，2次－－银染液20分钟－－－显色液2-10分钟－－终止液10分钟。完毕！

像海带是什么意思，都染黑了吗，首选确定是不是有蛋白，如果这个没问题那就是染色时间过长了，注意银染几分钟条带就出来了，一定要看着它着色，一旦觉得是最佳效果，要立刻换终止液终止反应

上面是我以前查的别人以及自己的经验，你可以参照着总结一下，大致步骤都差不多的

谢谢DF1。蛋白现在还不能确定有没有。但是MARKER也没有看到。染色时间可能是太长了。我再试试。