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常见亲脂性细胞膜染料DiO, Dil, DiR, Did光谱图和实验操作流程
Di 属于长链二烷基碳菁类染料，因其独特的结构使其具有极强亲脂性，可与脂溶性生物结构结合，在一定浓度下，可以对细胞膜进行完全染色。Di 染料被激发后具有很高的淬灭系数和激发态寿命，在细胞与组织定位示踪中起到了极大作用。
DiD（CAS：127274-91-3），DiO（CAS：34215-57-1），DiI（CAS：41085-99-8），DiR（CAS：100068-60-8）和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，佳浓度时可以使整个细胞膜染色。它们的荧光颜色区分明显：DiI(橙色荧光)，DiO(绿色荧光)，DiD(红色荧光)和 DiR (深红色荧光)这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分别用标准的 FITC和TRITC的滤光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激发，有着比DiI更长的激发波长和发射波长，在细胞和组织染色中更有价值。 DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。
常见的 Di 染料包括 DiO、DiI、DiD、DiR，在被激发后形成不同颜色的荧光 (如图 1)。
图 1. DiO、DiI、DiD、DiR 光谱图
DiO 染色为例，简要抛出体外实验步骤
a）接种适量数目的细胞，37°C 培养过夜。
b）去除培养基，离心收集细胞，加入 PBS 洗涤 2-3 次，每次 5 分钟。
c）加入对应浓度 DiO 工作液 (5-10 μM)，室温孵育 30 分钟。
d）400 g，4℃ 离心 3-4 分钟，弃去上清。再次加入 PBS 洗涤细胞 2-3 次，以充分去除未进入细胞内的DiO。
f）用无血清培养基或 PBS 重悬细胞后，在荧光显微镜或流式细胞仪下检测。
图 2. 实验流程简图
DiO
DiO 为绿色荧光染料，激发/发射波长为 483/501 nM，DiO 常被用于正向或逆向示踪各类细胞或组织。(但相较其他三种染料，DiO 染料荧光强度较弱，对于某些固定的组织切片染色效果略差)。
Xin Li 等人研究了 CPCs (心脏祖细胞) 衍生的外泌体 (CPCs-Ex) 是否可以利用 mTOR 信号通路来减少病毒性心肌炎的细胞凋亡。研究人员用 DiO 对 CPCs-Ex 进行标记 (Dio 可通过选择性分割被纳入细胞膜)，评估 H9C2 细胞对 CPCs-Ex 的体外摄取，荧光显微镜观察发现 H9C2 细胞的每个细胞质均包含荧光信号 (图 2)，并减少 H9C2 细胞的凋亡，确定了 CPCs-Ex 在 CVB3 感染细胞中的抗凋亡作用。
图 3. H9C2 细胞摄取 DiO 标记的外泌体[1]
DiI
DiI 为橙红色荧光染料，激发/发射波长为 551/569 nM，DiI 被用于正向或逆向示踪各类细胞或组织，荧光信号强度高于 DiO，在进入细胞膜时，其荧光信号会被大幅度放大。
如图 4 所示，Dil 染料标记外泌体，然后与目标细胞共培养。使用共聚焦显微镜捕捉 HOS 细胞对 Dil 标记外泌体的摄取，其中被标记的外泌体发出特异性橙红色荧光。
图 4. HOS 和 MG63 细胞摄取红色荧光染料 Dil 标记的 hBMSC-Exos[2]
DiD
DiD 为一种红色荧光染料，激发/发射波长为 646/663 nM，DiD 荧光信号高、不易淬灭、自身荧光干扰低，不仅用于细胞/组织染色，小动物活体成像中是最常用的。
Yuxuan Fu 等人研究出一种药物传输方法来达到抗新冠药物更好的进入靶器官的目的，研究者使用 DiD 标记细胞外小泡 (EV) 病毒蛋白的受体结合域 (EV-RBD) ，并进行小鼠尾静脉注射，通过荧光成像可以看到，信号主要在心脏、肺、肾脏中聚集，并且值得注意的是，在 96 h 时，标记的 EV-RBD 累积的荧光信号仍保留在肺组织中，这证明了该方法的可行性。
图 5. DiD 标记 EV-RBD 在小鼠体内分布情况亡[3]
DiR
DiR 是一种近红外染料，激发/发射波长为 754/778 nm，用于正向或逆向示踪各类细胞或组织，与 DiD 一样，DiR 自身荧光背景较低，也被用在活体成像中。
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