生物信息学分析鉴定肝细胞癌中的关键基因和信号通路

基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第9期，第4345-4352页研究报告ResearchReport生物信息学分析鉴定肝细胞癌中的关键基因和信号通路殷松娜张翔*杜娟陈雅慧延安大学医学院,延安,716000*通信作者,**********************摘要肝细胞肝癌是死亡率较高的癌种之一。本研究旨在为HCC的发生发展机制研究提供更多数据支从而对HCC的基因治疗提供一定的理论基础。从GEO数据库检索下载肝癌患者芯片数据GSE62232，持，包括10个正常肝脏样本，81个HCC患者的肿瘤样本。用Limma包分析HCC肿瘤组织中与正常肝组织中差异表达基因。随后进行基因本体论(GO)和信号通路(KEGG)富集分析。Cytoscape的MCODE插件用于分析差异基因的蛋白质相互作用关系。并筛选出Hub基因并应用Kaplan-Meier分析其在肝癌患者中的总体存活率情况。筛选得到237个DEGs(82个上调基因和155个下调基因)，主要富集在视黄醇代谢通路，P53信号通路和PPAR信号通路。从PPI网络中鉴定出2个关键子网络和29个Hub基因；并得到与肝癌患者预后不良相关的8个基因的生存曲线。本研究可为HCC的发生发展的机制研究和药物靶点提供新的研究方向。关键词肝细胞癌(HCC),差异基因,KEGG信号通路,蛋白质-蛋白质相互作用,Hub基因IdentificationofKeyGenesandPathwaysinHepatocellularCarcinomaUsingBioinformaticsAnalysisYinSongnaZhangXiang*DuJuanChenYahuiYan'anUniversityMedicalCollege,Yan'an,716000*Correspondingauthor,**********************DOI:10.13417/.039.004345AbstractHepatocellularcarcinoma(HCC)poseofthisstudyistoprovidemoredatafortheunderlyingmechanismofHCC,aydataofGSE62232wasdownloadedfromGEOdatabase,including10normalliversamples,ferentiallyexpressedgenes(DEGs)intheHCCtumortisseontology(GO)andKyotoEncyclopediaofGeneandGenomespathway(KEGG)ecularComplexDetection(MCODE)plug-ininCytoscapewasappliedtoidentifyprotein-proteininteraction(PPI)eswerepickedoutandtheKaplan-Meieranalysisforoverallsurvivalwasalsoapplied.237DEGswereidentified(82up-regulatedand155down-regulatedgenes),whichwereenrichedinretinolmetabolism,2modulesandtop29hubgeneswereidentifiedfromthePPInetwork;survivalcurudycodsHepatocellularcarcinoma(HCC),DEGs,KEGGpathway,PPI,Hubgene基金项目：本研究由陕西省教育厅专项项目(18JK0863)、陕西省教育厅专项项目(18JK0869)、延安大学博士科研启动项目(20504-0136)和延安大学校级引导项目(205100114)共同资助引用格式：YinS.N.,ZhangX.,DuJ.,andChenY.H.,2020,Identificationofkeygenesandpathwaysinhepatocellularcarcinomausingbioinformaticsanalysis,JiyinzuxueYuYingyongShengwuxue(GenomicsandAppliedBiology),39(9):4345-4352(殷松娜,张翔,杜娟,陈雅慧,2020,生物信息学分析鉴定肝细胞癌中的关键基因和信号通路,基因组学与应用生物学,39(9):4345-4352)

4346基因组学与应用生物学肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)在全球男性常见恶性肿瘤中占第5位，在全球女性中占第9位，每年约有500000和200000例新病例(Brayet早期的症状不明显，al.,2013)。由于HCC发病隐匿，多发预后不良，这也给HCC的治疗带来了极大的挑战。基因的靶向治疗是HCC治疗的一种有效的手段，因此，丰富和完善HCC的发病机制研究，并提供可供治疗的基因靶点对于HCC患者具有重大意义。本研究选取以HCC患者的肝脏肿瘤组织和正常人群的健康肝脏组织为研究对象，基于HCC高通量基因芯片数据，利用生物信息学分析可能在HCC发生发展以及治疗方面提供新的研究方向。本研究针对HCC患者的肝脏肿瘤组织和正常人群的健康肝脏组织筛选出两组间表达有差异的基因，并将差异基因进行GO功能分析和KEGG信号通路分析，构建了差异基因编码蛋白的相互作用网络图，利用Cytoscape软件筛选出了Hub基因，并且分析得到了其中与HCC不良预后具有相关性的关键基因，为HCC的发病机制和基因的靶向治疗的研究提供新的方向和理论基础。1结果与分析1.1差异基因分析利用Limma包筛选到237个表达具有显著差异的基因，其中表达量上调的基因有82个，表达量下调的基因有155个(图1)。1.2差异基因的GO和KEGG信号通路分析R语言中利用ClusterProfiler包对筛选到的差异基因进行GO和KEGG信号通路分析，结果显示差异基因在生物学进程中主要富集在类固醇代谢过程和细胞对无机物质的反应等(图2A)；在细胞组成方面主要富集在浓缩染色体，着丝粒区域和血液微粒等(图2B)；在分子功能上主要富集在氧气结合和铁离子结合等(图2C)；KEGG信号通路分析结果显示差异基因主要富集在P53信号通路、PPAR信号通路和视黄醇代谢通路等(图2D)。1.3差异基因蛋白质互作网络中的关键子网络和Hub基因分析首先利用STRING构建了差异基因蛋白质互作网络图(图3)；再利用Cytoscape软件对该网络图进行分析，分析获得Score＞8的2个关键子网络(图4)；并获得Degree＞20的Hub基因29个(表1)。图1差异基因注:红色:高表达;绿色:低表达;黑色:无差异Figure1VolcanoofDEGsNote:Red:Higherexpressionlevel;Green:Lowerexpressionlevel;Black:Nodifferential表1差异基因中的Hub基因(degree>20)Table1HubgenesintheDEGs(degree>20)基因度数基因度数GeneDegreeGeneDegreeZWINT28DLGAP528TOP2A28CDKN328RRM228CDK128RACGAP128CCNB128PRC128CCNA228PBK28BUB1B28NUSAP128ASPM28NUF228ANLN28NEK228TYMS27NDC8028BIRC527NCAPG28AURKA27MLF1IP28UBE2T26MAD2L128ECT226HMMR28HELLS25DTL281.4Hub基因在肝癌患者中的生存曲线分析利用KaplanMeier-plotter对29个Hub基因在肝癌患者中的预后情况进行分析，发现其中8个基因与肝癌患者的不良预后相关，包括ZWINT(HR=2.36,logrankP=8.5×10-7)、RRM2(HR=2.01,logrankP=5.5×10-5)、NCAPG(HR=2.19,logrankP=8.8×10-6)、MLE1P(HR=1.53,logrankP=0.016)、HMMR(HR=2.29,logrankP=1.3×10-6)、CDK1(HR=2.15,logrankP=1.1×10-5)、TYMS(HR=1.97,logrankP=8.4×10-5)和ECT2(HR=

生物信息学分析鉴定肝细胞癌中的关键基因和信号通路4347图2差异基因所涉及的细胞生物学过程,细胞组分和分子功能,以及KEGG信号通路分析Figure2Thebiologicalprocess,cellularcomponent,andmolecularfunctionterms,andKEGGpathwaysenrichedbytheDEGs

4348基因组学与应用生物学图3差异基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析Figure3Protein-proteininteractionnetworkofDEGs2.09,logrankP=2.3×10-5)(图5)。以及新的药物靶点提供新的方向。本研究利用生物信息学方法对从GEO数据库中所下载的HCC患者的肿瘤及正常人群的健康肝脏组织的生物芯片数据进行分析。首先利用limma包分析了HCC患者肿瘤组织和正常人群的健康肝脏组织中的差异基因，筛选得到237个差异基因(82个上调,155个下调)。随后对分析所得的差异基因进行功能富集分析，结果表明HCC患者中的差异2讨论由于HCC发病具有隐匿性，而且早期症状不明显，多发预后不良。所以，HCC是全球癌症死亡的第二大原因，这也使得HCC的临床治疗面临着巨大的挑战(LinandKao,2018)。因此，在HCC患者之中寻找新的靶向基因可望为探究HCC的发生发展机制，

生物信息学分析鉴定肝细胞癌中的关键基因和信号通路4349图4PPI网络中的2个关键子网络Figure4Top2modulesfromthePPInetwork基因主要富集在类固醇代谢过程、细胞对无机物质的反应以及细胞对金属离子的反应中；KEGG信号通路分析结果显示HCC患者中的差异基因主要富集在化学致癌作用、P53信号通路、外源异生物经细胞色素P450代谢途径、PPAR信号通路和视黄醇代谢通路。利用STRING数据库对筛选所得的差异基因构建了蛋白质互作网络图，使用Cytoscape软件对该蛋白质互作网络图分析得到Score＞8的关键子网络2个，Degree＞20的Hub基因29个，随后，利用KaplanMeier-plotter对29个Hub基因在肝癌患者中的预后情况进行分析，发现其中8个基因：ZWINT、RRM2、NCAPG、MLF1IP、HMMR、CDK1、TYMS和ECT2与HCC患者的不良预后相关。ZWINT是有丝分裂纺锤体检查点所需的着丝粒复合物成分，在人类不同的癌症中过度表达，但其在肝细胞癌(HCC)中研究很少，目前仅有研究发现过表达ZWINT可促进HCC细胞的增殖，其可能是通过影响与细胞周期相关的PCNA、cyclinB1、Cdc25C和CDK1的表达实现此功能(Yingetal.,2018)。核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)在DNA合成和修复中起重要作用(Duxburyetal.,2004)，对细胞迁移和增殖至关重要，有研究证明抑制RRM2表达可以抑制HCC细胞的增殖和迁移，RRM2有望作为HCC治疗的新的候选靶点(Gaoetal.,2013)。NCAPG是HCC细胞增殖和迁移所需的新型有丝分裂基因，敲减NCAPG能够抑制HCC细胞的生长，NCAPG的过表达与CCNB1(G2,有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1,一种参与有丝分裂的调节蛋白)的过表达显着相关(Zhangetal.,2018)。因此，NCAPG可能为将来治疗晚期HCC提供新的治疗靶点。有研究发现，通过CDK1抑制剂RO3306阻断CDK1/PDK1/β-连环蛋白信号传导，在HCC的临床前模型中能够靶向癌症干细胞来增加索拉非尼对HCC的治疗功效(Wuetal.,2018)。胸苷酸合成酶(TYMS)是叶酸代谢中的关键限速酶，在包括HCC在内的多种恶性肿瘤的发展中起着重要作用(Zhouetal.,2018)。癌症的早期复发是改善HCC患者预后的主要障碍，而ECT2可以通过调节Rho/ERK信号通路以促进人HCC的早期复发(Chenetal.,2015)。还有研究发现，髓细胞白血病因子-1相互作用蛋白(MLF1IP)能够促进正常的红细胞增殖，并参与真性红细胞增多症的发生(Fengetal.,2017)，并参与胶质母细胞瘤和前列腺癌的肿瘤发生(Hanissianetal.,2015)，然而，其在HCC中的作用尚不清楚。有研究发现，HMMR作用于PLK1依赖的纺锤体定位途径并支持神经发育(Connelletal.,2017)。HMMR是基底样乳腺癌(BLBC)中必需的癌症相关基因，组织多糖透明质酸(HA)是促进乳腺癌发展的癌性微环境中的ECM组分，其通过结合HA受体如CD44和RHAMM/HMMR来促进肿瘤和宿主细胞内的存活，迁移和侵袭(Liuetal.,2016)，然而其在HCC中的作用尚不清楚。综上所述，本研究筛选所得的Hub基因可为探究HCC的发生发展提供新的研究方向，并为HCC的治疗提供新的基因靶点以供分析。

4350基因组学与应用生物学图5不同Hub基因在HCC患者中的预后价值注:A:ZWINT基因在HCC患者中的预后情况;B:RRM2基因在HCC患者中的预后情况;C:NCAPG基因在HCC患者中的预后情况;D:NCAPG基因在HCC患者中的预后情况;E:HMMR基因在HCC患者中的预后情况;F:CDK1基因在HCC患者中的预后情况;G:TYMS基因在HCC患者中的预后情况;H:ECT2基因在HCC患者中的预后情况;HR:暴露水平时的风险率Figure5PrognosticvalueofdifferentHubgeneinHCCpatientNote:A:PrognosticvalueofZWINTinHCCpatien;B:PrognosticvalueofRRM2inHCCpatient;C:PrognosticvalueofNCAPGinHCCpatient;D:PrognosticvalueofNCAPGinHCCpatient;E:PrognosticvalueofHMMRinHCCpatient;F:PrognosticvalueofCDK1inHCCpatient;G:PrognosticvalueofTYMSinHCCpatient;H:PrognosticvalueofECT2inHCCpatient;HR:HazardRate

生物信息学分析鉴定肝细胞癌中的关键基因和信号通路43513材料与方法3.1肝癌样本与正常组织样本基因芯片的获取基因芯片GSE62232从美国国立生物技术信息中心GEO数据库中下载。该数据为人类肝细胞癌与正常肝脏组织的mRNA表达芯片原始数据，实验平台为GPL570，以Affymetrix的U133plus2.0Array基因表达谱芯片检测完成。该数据中包括91个样本，其中肝细胞癌组织样本81个，做为对照组的正常肝脏组织10个。3.2差异基因的筛选使用Limma包(Ritchieetal.,2015)对GSE62232芯片数据中肝细胞癌组织和正常肝脏组织中的差异基因进行筛选，差异基因的筛选条件为：PValue＜0.05、log|FC|＞2(logFC＞2的为上调基因,logFC＜2的为下调基因)。本研究中筛选到237个差异基因，其中包含82个上调基因和155个下调基因，并使用Pheatmap包绘制差异基因火山图。3.3GO和KEGG富集分析GO分析可对高通量基因组或转录组数据中的基因从以下3个不同层面进行分析，分子功能(molecularfunction,MF)，生物学过程(biologicalpro-cess,BP)、细胞组分(cellularcomponent,CC)这3种属性做出分析(Ashburneretal.,2000)。KEGG是一个可实现对基因进行功能分析及预测的数据库,并联系基因组信息和功能信息的数据库(AltermannandKlaenhammer,2005)。使用clusterProfiler包(Yuetal.,2012)对差异基因进行GO和KEGG分析，其中GO分析的筛选条件为p<0.01，q-value<0.05，KEGG分析的筛选条件为p<0.05。3.4蛋白质相互作网络分析STRING是一个能够通过已知的实验结果以及预测功能对蛋白质间的相互作用关系进行评价预测的数据库(Szklarczyketal.,2015)。利用STRING数据库对差异基因编码蛋白质进行互作网络分析，筛选条件为confidencescore>0.4，maximumnumberofin-teractors=0。将分析得到的蛋白质互作网络图导入Cytoscape(3.4.0版)软件进行可视化分析，利用其中的MolecularComplexDetection(MCODE)程序分析蛋白质互作网络中的关键子网络，分析获得2个关键子网络；并根据蛋白质互相作用网络图之间的连接度分析差异基因中的Hub基因，筛选条件为de-gree＞20，本次筛选获得29个Hub基因。3.5Hub基因的生存曲线分析KaplanMeier-plotter(KMplotter,/analysis/)能够利用10461个癌症样本来评估54675个基因对癌症患者的生存影响，其数据的采集平台依赖于GEO(仅限Affymetrix微阵列数据)，EuropeanGenome-phenomeArchive(EGA)和TheCancerGenomeAtlas(TCGA)数据库。作者贡献殷松娜是本研究的设计者和执行人；殷松娜和张翔完成数据分析，论文初稿的写作；杜娟参与数据分析；陈雅慧参与文章的校队；张翔是项目的构思者及负责人，指导文章设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。致谢本研究由陕西省教育厅专项项目(18JK0863)、陕西省教育厅专项项目(18JK0869)、延安大学博士科研启动项目(205040136)和延安大学校级引导项目(205100114)共同资助。参考文献AltermannE.,andKlaenhammerT.R.,2005,PathwayVoyager:pathwaymappingusingthekyotoencyclopediaofgenesandgenomes(KEGG)database,BMCGenomics,6:60AshburnerM.,BallC.A.,BlakeJ.A.,BotsteinD.,ButlerH.,CherryJ.M.,DavisA.P.,DolinskiK.,DwightS.S.,EppigJ.T.,HarrisM.A.,HillD.P.,Issel-TarverL.,KasarskisA.,LewisS.,MateseJ.C.,RichardsonJ.E.,RingwaldM.,RubinG.M.,andSherlockG.,2000,Geneontology:toolfortheu-nificationofbiology,TheGeneOntologyConsortium,.,25(1):25-29BrayF.,RenJ.S.,MasuyerE.,andFerlayJ.,2013,Globalesti-matesofcancerprevalencefor27sitesintheadultpopula-tionin2008,.,132(5):1133-1145ChenJ.,XiaH.,ZhangX.,KarthikS.,PratapS.V.,OoiL.L.,HongW.,andHuiK.M.,2015,ECT2regulatestheRho/ERKsignallingaxistopromoteearlyrecurrenceinhumanhepatocellularcarcinoma,l.,62(6):1287-1295ConnellM.,ChenH.,JiangJ.,KuanC.W.,FotovatiA.,ChuT.L.,HeZ.,LengyellT.C.,LiH.,KrollT.,LiA.M.,GoldowitzD.,FrappartL.,PloubidouA.,PatelM.S.,PilarskiL.M.,Simp-sonE.M.,LangeP.F.,AllanD.W.,andMaxwellC.A.,2017,HMMRactsinthePLK1-dependentspindlepositioning

4352基因组学与应用生物学pathwayandsupportsneuraldevelopment,eLife,6:e28672DuxburyM.S.,ItoH.,ZinnerM.J.,AshleyS.W.,andWhangE.E.,2004,RNAinterferencetargetingtheM2subunitofribonu-cleotidereductaseenhancespancreaticadenocarcinomachemos-ensitivitytogemcitabine,Oncogene,23(8):1539-1548FengG.,ZhangT.,LiuJ.,MaX.,LiB.,YangL.,ZhangY.,XuZ.,QinT.,ZhouJ.,HuangG.,ShiL.,andXiaoZ.,2017,MLF1IPpromotesnormalerythroidproliferationandisin-volvedinthepathogenesisofpolycythemiavera,FEBSLett.,591(5):760-773GaoJ.,ChenH.,YuY.,SongJ.,SongH.,SuX.,LiW.,TongX.,QianW.,WangH.,DaiJ.,andGuoY.,2013,Inhibitionofhepatocellularcarcinomagrowthusingimmunoliposomesforco-deliveryofadriamycinandribonucleotidereductaseM2siRNA,Biomaterials,34(38):10084-10098HanissianS.H.,TengB.,AkbarU.,JanjetovicZ.,ZhouQ.,DuntschC.,andRobertsonJ.H.,2005,Regulationofmyeloidleukemiafactor-1interactingprotein(MLF1IP)ex-pressioninglioblastoma,.,1047(1):56-64LinC.L.,andKaoJ.H.,2018,Reviewarticle:thepreventionofhepatitisB-relatedhepatocellularcarcinoma,.,48(1):5-14LiuW.,MaJ.,ChengY.,ZhangH.,LuoW.,andZhangH.,2016,HMMRantisenseRNA1,anovellongnoncodingRNA,regulatestheprogressionofbasal-likebreastcancercells,BreastCancer,8:223-229RitchieM.E.,PhipsonB.,WuD.,HuY.,LawC.W.,ShiW.,andSmythG.K.,2015,LimmapowersdifferentialexpressionanalysesforRNA-sequencingandmicroarraystudies,Nucle-icAcidsRes.,43(7):e47SzklarczykD.,FranceschiniA.,WyderS.,ForslundK.,HellerD.,Huerta-CepasJ.,SimonovicM.,RothA.,SantosA.,TsafouK.P.,KuhnM.,BorkP.,JensenL.J.,andvonMeringC.,2015,STRINGv10:protein-proteininteractionnetworks,integrat-edoverthetreeoflife,NucleicAcidsRes.,43(D):447-452WuC.X.,WangX.Q.,ChokS.H.,ManK.,TsangS.H.Y.,ChanA.C.Y.,MaK.W.,XiaW.,andCheungT.T.,2018,BlockingCDK1/PDK1/beta-CateninsignalingbyCDK1inhibitorRO3306increasedtheefficacyofsorafenibtreatmentbytar-getingcancerstemcellsinapreclinicalmodelofhepatocel-lularcarcinoma,Theranostics,8(14):3737-3750YingH.,XuZ.,ChenM.,ZhouS.,LiangX.,andCaiX.,2018,OverexpressionofZwintpredictspoorprognosisandpromotestheproliferationofhepatocellularcarcinomabyregulatingcell-cycle-relatedproteins,OncoTargetsTher.,11:689-702YuG.,WangL.G.,HanY.,andHeQ.Y.,2012,ClusterProfiler:anRpackageforcomparingbiologicalthemesamonggeneclusters,Omics,16(5):284-287ZhangQ.,SuR.,ShanC.,GaoC.,andWuP.,2018,Non-SMCcondensinIcomplex,subunitG(NCAPG)isanovelmitoticgenerequiredforhepatocellularcancercellproliferationandmigration,.,26(2):269-276ZhouJ.,HanS.,QianW.,GuY.,LiX.,andYangK.,2018,Met-formininducesmiR-378todownregulatetheCDK1,leadingtosuppressionofcellproliferationinhepatocellularcarcino-ma,OncoTargetsTher.,11:4451-4459