depc水

1. 首先需要明确，DEPC（焦碳酸二乙酯）是一种油状液体，跟水难容。故配置时室温通风橱中完成，常常需要放置过夜。

DEPC在高压下会分解为CO2和乙醇，所以，如果你的DEPC水是用来处理实验器具的，就不能高压；如果你的DEPC水是用来配制试剂的，那么你就可以高压。不过不管你配制DEPC水的目的是什么，在配制DEPC水时的双蒸水都不需要高压灭菌，因为即便是你用来处理器具，在泡过DEPC水之后还必须要经过高压灭菌滴。

泡实验器具的DEPC水的配制（0.1%）：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后或过夜备用。保存方法：封闭冷藏备用。 最好分装小瓶来用，尽量避免污染。 毕竟搞一次也不容易。

配试剂的DEPC水的配制（0.1%）：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，高压处理121c，25min DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。 最好分装小瓶来用，尽量避免污染。 搞一次也不容易。

2.焦碳酸二乙酯（DEPC） DEPC即diethyl pyrocarbonate。分子式为C6H10O5，分子量为162.14，无色、澄清透明的液体。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。DEPC可以抑制植物细胞上的NSCC，是常用的NSCC抑制剂.DEPC毒性

1．DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 是一种高效烷化剂。DEPC不稳定，在水溶液中会分解成乙醇和二氧化碳，155℃时也会分解。DEPC遇到氨水会发生反应产生氨基甲酸乙酯。 2．DEPC有刺激性，对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心沾到手上注意立即冲洗。 3．DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。DEPC在水中的半衰期： 25℃、磷酸缓冲液中其半衰期为4 min（pH 6）、9 min（pH 7）。Tris缓冲液中DEPC的降解会加快，25℃时，半衰期为1.25 min（pH 7.5）、0.37 min（pH 8.2）。

DEPC加入到水中之后并不会立即溶解，而是形成小的球状液滴（类似于油滴），需要彻底搅拌直至液滴消失才算混合均匀。此时的溶液才可以拿去高温除菌除DEPC。一般灭菌15min即可将DEPC彻底除去。（试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。）

配置

加0.1% DEPC到去离子水中，混匀过夜，然后高温高压121℃，20min，DEPC即降解成二氧化碳和水，无毒。

用途

DEPC是一种有效的核酸酶抑制剂，它能够与很多酶的-NH，-SH或-OH等基团发生反应，从而破坏酶的活性位点。一般，常用浓度为0.1%（1 L水中加入1 mL DEPC）的DEPC来作为RNA酶的抑制剂。比如，进行RNA实验时，要用DEPC处理实验所用的水和各种溶液。 我们通常所说的DEPC（处理）水是指用DEPC处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。DEPC（处理）水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。

使用注意事项

1、DEPC可能溶解掉某些塑料枪头，因此，量取DEPC时要用玻璃器具。

2、DEPC处理后的溶液要去除残余的DEPC，一般121℃灭菌15 min即可，也可以将其煮沸15 min以达到去除的效果。可能会残留些许气味，可以放心使用。

3、因为DEPC在Tris、HEPES等缓冲液中极易分解，因此不能直接用DEPC来处理Tris、HEPES等缓冲液。这种情况下，要先用DEPC处理水，然后再用DEPC处理过的水来配制缓冲液。

4、Although H2O prepared with reverse osmosis systems like Milli-Q is free of RNases, it

can be contaminated by microbial growth if the machine and piping are not well

maintained. This is especially problematic in centralised water systems with metres of

piping.

5、The fruity smell coming from ageing DEPC-containing solutions stems from the esters

that are generated when ethanol produced from hydrolysis reacts with residual carboxylic

esters. It is normal that some fruity smell lingers after DEPC removal and is not necessarily

a sign of incomplete DEPC hydrolysis.

安全问题及替代产品

DEPC is carcinogenic (it carboxymethylates purines) and should be handled with care.

Wear gloves!

Dimethylpropyl carbonate (DMPC), a safer alternative to DEPC, is used in exactly the

same way.

3. 分子克隆第二版343页，上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法，是用前180度干烤8小时或更长时间；另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37度2小时)，然后灭菌水淋洗数次，100度干烤15分钟，然后高压灭菌除去depc.我们实验室一直是用170度考4小时，且不准离人，不准过夜，可能是怕烤箱长时间高温，线路老化会发生危险吧。

提取RNA所用的枪头，EP管。直接高压烘干即可。如果用0.1％DEPC处理，要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头，EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会。

A.对于提取RNA来说，我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备，保存，以及之后的试剂的准备，匀浆器，镊子，tip头的去除RNase处理，尤其是去除RNase的DEPC处理步骤

B.您在处死大鼠前，先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以，就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆，您的注意安全)，然后将去除的骨骼肌立即用干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小，装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPC处理

C.在提取RNA之前，将试剂(TRIzol)和器械(tip头，镊子，匀浆器)都准备好

D.从液氮取出标本后，立即转移进入事先加入TRIzol的匀浆器内(最好置冰上操作)，立即匀浆，一直到标本完全碾磨碎，这个时候TRIzol液体成浑浊状，而且匀浆器的壁上没有太多的黏附组织，然后将TRIzol转出，继续后续的步骤。

1 Rnase是一种蛋白酶，能够降解RNA。

2我们的手上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。保护不被RNA病毒感染？或者什么的。

3 这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时，要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。

4 所谓DEPC，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓DEPC水，一般指两种状态，a，配制 好未消毒；b，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒。

1 无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌4小时以上至完全溶解，高压灭菌20分钟，冷却备用。这个是DEPC水的b状态。

2 如果你要用DEPC水处理Tips等等东东，那么就要用高压前的水，即DEPC水的a状态。把枪头管子等完全浸泡至少8小时，我一般都是过夜的，或者平时就泡在里面备用。

RNA提取必须创造无RNase的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理：

研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在180℃烘干4h以上； 电泳槽、胶板、梳子、用0.1 %～0.2%DEPC水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用0.5%的SDS (Sodium dodecyl sulfate，抑制RNase的活性)浸泡过夜，然后用ddH2O冲洗干净，晾干备用；离心管，枪头等塑料器皿要用0.1%～0.2%DEPC水处理之后(DEPC有致癌之嫌，须小心操作)。37℃保温12h以上，然后高压灭菌，灭活DEPC ( Diethypyrocarbonate )；溶液都需用经DEPC处理过的水配置， RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。

我们研究所里提RNA用的枪头和EP管都是高压两遍的，没有用DEPC水处理。

1、 有灭菌过的DEPC水，这一般是用来配75%乙醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以乙醇是新开封专用的。

2、 没有经高压灭菌的DEPC水，这主要是用于配你提RNA所用的其他试剂（所说的试剂是可以经高压灭菌的），总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去除DEPC，以防止它以随后实验的干扰。

3、 DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌4小时以上，121 度高压灭菌20分钟，冷却备用。

凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂.

为啥在28s之后还是有影影约约的片断？和模糊的smear？

这都与非变性电泳方式有关。RNA 的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们平时所知道的 RNA 电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电泳实在是太方便了，同时，就一般检测而言，完全可以替代变性电泳，所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。

电泳时间太长了容易产生降解。最好是在120V左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套，注意，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响RNA的质量。无论你是提什么RNA只要是用异丙醇沉淀的，都得用75％的酒精洗涤一次。

1 样品不要太多，抽提务必充分，室温放置5min；

2 200ul氯仿 剧烈振荡20s，室温放置2－15min；

3 13000g 离心 15min；

4 取上层水相，一般400-450ul就足够了，千万不要贪多！***

5 加入500ul异丙醇 摇匀，室温放置10min；

6 12000g 离心 10min；

7 75％乙醇 1000ul 洗涤沉淀；

8 7500g 离心 5min；（12000转速太高了吧，沉淀不容易溶解的）

9 弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇， 室温干燥3－5min；（时间太久沉淀不易溶解）

10 适量DEPC水溶解沉淀。

电泳的上样量1ug，电泳buffer用DEPC处理的水配制，电泳时间不要太久，95V，10－15min足够了。

建议跑RNA电泳。先用2％琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入RNA酶抑制剂。注意观察带形，质量较好的RNA亮度 。28S:18S应为2:1。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有带， 若有，可能为基因组DNA污染。 OD值只有1.5，可能为基因组DNA污染。参考一下分子克隆3。上面有OD值与 污染DNA的关系。建议，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的RNA样品可用无RNA酶的DNA酶消化一下。注意该酶的buffer中有一种物质在OD260有吸光度，应严格按照其protocol操作，减少误差。

只要用DEPC处理过的水，打开一瓶新的无水乙醇（或者专用于RNA的，即只用处理过的枪头取过乙醇的）配就可以了。DEPC高温高压时变成CO2和水，再加上乙醇也很容易气化，可能是因为有气体产生吧，如果盖子太紧容易发生瓶子破掉的事情。（我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过）而且，湿热灭菌本身不足以去除RNA酶，所以我觉得有时候，灭菌可能反而引入RNA酶污染也不一定哦

75%的乙醇用于提取RNA 时最好还是现用现配，乙醇最好是新的且以后不要用于其他方面，也就是留一瓶专门用于提取RNA。DEPC一般高压灭菌30分钟就可以了！

75%乙醇：灭菌后的千分之一DEPC水25ml+75ml无水乙醇.配好后装入高温烘烤的玻璃瓶中（160干烘四小时），或塑料器皿的用千分之一的DEPC泡12小时以上再灭30分钟，存放于低温冰箱4℃保存。 提示：本文RNA提取及用DEPC去除RNase的总结属于技术文章文章，主要介绍RNA提取、RNase方面的知识