高粱枯萎病生防菌株筛选研究

第

39

卷第

3

期2021

年

05

月干旱地区农业研究Agricultural

Research

in

the

Arid

AreasVol.39

No.3May

2021文章编号：1000-7601(2021)03-0237-08

doi

：10.7606/.1000-7601.2021.03.30高粱枯萎病生防菌株筛选研究马文旭，陈如男，刘新宇，李博浩，贾文宝，张严文，

杨雁，赵千慧，曹东歌，于高波，魏金鹏(黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆163319)摘要：由半裸镰刀菌引起的高粱枯萎病是一种严重的土传病害，为了有效地抑制高粱枯萎病的发生，筛选出

对该病害具有较强抑制活性的生防菌株。从黑龙江省大庆市土壤中分离出33种生防菌，采用平板对峙法从33种菌

株中筛选出对半裸镰刀菌具有抑制作用的生防菌株，并进行盆栽高粱接菌试验，通过高粱枯萎病的病情指数与发病

率调查，筛选出4种拮抗细菌Y+8、7、10+8-20、Y+6，其平板抑制率分别达到83.55%

,85.87%、85.67%、89.33%

；生防

菌接菌高粱的枯萎病发病率分别为37.93%、30.77%、30.77%、42.33%，显著低于对照；病情指数分别为18.97、22.12、

30.77、16.92。分子鉴定结果表明，这4种生防效果较好的拮抗菌分别为Aquamicrobium、短小芽孢杆菌(Bacillus)、短

波单胞菌(Brevundimonas)、芽孢杆菌(Bacillus')

o

4种生防菌在高粱叶片中诱导了

H2O2等活性氧信号的产生，显著提

高了高粱相关抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸(APX),并提高了防御酶苯

丙氨酸解氨酶(PAL)与多酚氧化酶(PPO)的活性。此外,4种生防菌在防治病害发生的同时，显著提高了土壤脲酶、

磷酸酶、多酚氧化酶、纤维素酶的酶活性。综上所述，生防菌株Aquamicrobium、芽孢杆菌(Bacillus)、短波单胞菌(Bre-

vundimonas)与芽孢杆菌(Bacillus)能够有效地增强高粱防御系统，增强土壤酶活性，抑制高粱枯萎病的发生，在高粱

枯萎病生物防治中具有潜在的应用前景。关键词：高粱枯萎病；生防菌株;抗氧化酶；土壤酶中图分类号:S435.14

文献标志码：AScreening

of

biocontrol

bacteria

against

sorghum

Fusarium

wiltMA

Wenxu,

CHEN

Runan,

LIU

Xinyu,

LI

Bohao,

JIA

Wenbao,

ZHANG

Yanwen,

YANG

Yan,

ZHAO

Qianhui,

CAO

Dongge,

YU

Gaobo,

WEi

Jinpeng

(Heilongjiang

Bayi

Agricultural

University,

Daqing,

Heilongjiang

163319,

China)Abstract:

Sorghum

Fusarium

wilt

is

a

serious

soil

borne

disease.

In

order

to

inhibit

the

occurrence

of

sorghum

blight

effectively,

it

is

necessary

to

screen

for

bio-control

strains

with

strong

inhibitory

activity

to

against

the

disease.

Thirty-three

kinds

of

bio-control

bacteria

were

isolated

from

soil

using

the

method

of

tablet

confrontation

in

this

study，

which

were

infected

to

sorghum

with

Fusarium

wilt

in

pot

test.

Through

the

sorghum

blight

disease

index

and

the

incidence

of

a

disease,

4

kinds

of

antagonistic

bacteria

Y+8

,

7

,

10+8-20,

and

Y+6

were

selected

,

with

the

inhibition

rate

of

the

tablet

at

83.

55%，

85.

87%，

85.

67% and

89.

33%，

respectively.

The

incidence

of

Fusarium

wilt

were

37.93%，

30.77%，

30.77%

and

42.33%，

respectively，

which

were

significantly

lower

than

the

control

group.

The

disease

indexes

were

18.

97，

22.

12，

30.

77，

and

16.

92，

respectively.

The

molecular

identification

results

showed

that

the

four

kinds

of

antagonistic

bacteria

with

better

biocontrol

effect

were

Aquami­crobium

,Bacillus

,

Brevundimonas,

and

Bacillus.

The four

biocontrol

bacteria

induced

the

production

of

reactive

ox­ygen

species

in

sorghum

leaves,

such

as

H2O2

,

and

improved

the

activity

of

antioxidant

enzymes

significantly,

in­cluding

superoxide

dismutase

(

SOD)

,

peroxidase

(

POD)

,

ascorbic

acid

(

APX)

,

and

also

enhanced

the

activity收稿日期：2020-10-15

修回日期：2020-12-05基金项目：国家自然科学基金(31301769)；黑龙江省自然科学基金(QC2018023)；黑龙江省大学生创新创业训练项目“高粱枯萎病生防菌

的筛选及防病机理的研究”(2)作者简介：马文旭(1998-)，男，黑龙江哈尔滨人，研究方向为植物病害生物防治。E-mail：*****************通信作者；魏金鹏(1982-)，男，黑龙江大庆人，主要从事高粱逆境生理学研究。E-mail：***************

238干旱地区农业研究第

39

卷of

defense

enzymes,

containing

phenylalanine

ammonialyase

(

PAL)

and

polyphenol

oxidase

(

PPO)

.

In

addition,

the

activity

of

soil

urease,

phosphatase,

polyphenol

oxidase,

and

cellulase

were

significantly

induced

by

the

four

biocontrol

bacteria.

In

summary,

the

biocontrol

bacteria,

Aquamicrobium,

Baci//us,

Brevundimonas,

and

Baci//us

could

effectively

enhance

the

sorghum

defense

system,

increase

the

soil

enzyme

activity,

and

inhibit

the

occurrence

of

sorghum

Fusarium

wilt,

showing

a

potential

application

prospect

in

the

biological

prevention

of

sorghum

Fusarium

ds:

sorghum

wilt；

biocontrol

strain；

antioxidant

enzymes；

soil

enzyme高粱是世界上重要的杂粮作物，常被用作制

糖、酿酒等工业原料，是我国粮食化产业必不可少

解决的关键问题。因此，本研究从黑龙江省大庆市

的健康高粱根际土壤中筛选出33种具有拮抗效果

的农作物之一。而高粱病害是制约其产量的重要

因素之一,高粱病害约有60余种［1］,发生较普遍的

有15种［2］o其中由半裸镰刀菌侵染引起的高粱枯

萎病发生较为严重,在高粱生长到4~5片叶时即可

发生，且为土传病害。已有研究表明其致病菌为镰

刀菌属，其可在土壤中传播，通过高粱根系侵入其

地上部分,

导致高粱生长缓慢,

叶片枯萎等,

严重时

可导致高粱产量显著下降［3］o除此以外，孙纪申

等⑷研究发现半裸镰刀菌是高粱、小麦等粮食上常

见的污染菌，其菌内含致癌物可致大鼠淋巴肉瘤和

膀胱乳头瘤，但能否引起人类肿瘤尚在研究。目前

针对农作物病害的主要防治措施包括选育抗病品

种、采用轮套作、使用化学农药等方法,但抗病品种

存在选育年限较长、品种适种地域有限的问题，轮

作方式也存在时间周期长、经济效益受影响等问

题。化学农药在一定程度上能抑制植物病害的发

生，贺新生等［5］发现克霉灵可有效抑制半裸镰刀菌

的菌丝体生长与抱子萌发,但是会产生农药残留危

害与环境污染问题。而随着人们的环境保护观念

越来越强,对绿色无公害、健康无污染农副产品的

需求也越来越高。生物防治具有无毒、健康无污染

等优点［6］，因此，采用生物防治实现绿色生产，为农

业的可持续发展提供重要的保障。事实上，生物防治已成为解决作物病害的重要

防治方法之一。近年来关于高粱生防菌的研究也

逐步增多,Sollepura等［7］筛选出20种具有生防潜力

和促进高粱生长的内生真菌，姜钰等［8］针对高粱靶

斑病的生防防治开展了相关研究。对于镰刀菌所

引起的病害，在生防菌的研究方面有较多相关研

究。已有研究发现对黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、番

茄黄萎病等多种病原菌有抑制作用的生防菌株，季

倩茹等［9］发现芽抱杆菌对黄瓜枯萎病具有良好的

防病促生效果,但对于高粱枯萎病致病菌一半裸

镰刀菌的生防研究甚少。因此，高粱枯萎病的生防

菌筛选及生物防治作用已成为高粱绿色生产亟待

的生防细菌，通过平板对峙试验与盆栽接种试验进

行筛选,并对半裸镰刀菌有良好生防效果的菌株进

行分子鉴定及生防作用研究，以期为防治高粱枯萎

病的菌剂研发奠定基础，也为实现高粱的绿色生产

提供理论依据与技术支持。1材料与方法1.1材料1.1.1供试植物材料

克杂1号高粱品种，由国家

杂粮工程技术研究中心提供。1.1.2

供试菌株

病原菌：半裸镰刀菌(Fusarium

semitectum)由黑龙江八一农垦大学台莲梅教授提

供。生防菌:本试验从黑龙江省大庆市的健康高粱

根际土壤中分离纯化，并经过初步的抑菌谱筛选出

生防菌株33种。1.1.3供试培养基PDA培养基，牛肉膏蛋白

胨培养基。1.2方法1.2.1平板对峙法初筛生防菌将半裸镰刀病原

菌活化，将直径6

mm的菌碟置于平板培养基的中

心，将生防菌菌液接种于平板1/4处,以单独接种病

原菌为对照,28*下培养3

d,并进行多次重复，计算

抑菌率，筛选抑菌效果较好的拮抗菌［10］。抑菌率(％)=(对照病原菌半径-生防菌对峙

的病原菌半径)/对照病原菌半径X1001.2.2生防菌分子鉴定

将筛选出来的4种菌株

通过细菌基因组试剂盒进行提取16SrDNA并进行

PCR

扩增，扩增引物为

F：5'

-

AGAGTTTGATCCTG-

GCTCAG-3'与

R：5'

-TACCTTGTTACGACTT-3

',

反应程序：94*

5

min;

94*

1

min;

72*

2

min;

35Cycles

；

72*

7

min,

4*保存,电泳检测,PCR产物

测序，测序结果进行同源性比对(http：//www

.ncbi.

/)，选择同源性99%以上的序列

用MEGA7.0建立发育树，确定菌株的种属。1.2.3

生防菌对高粱枯萎病影响的盆栽试验盆

第3期马文旭等:高粱枯萎病生防菌株筛选研究239栽试验设置6个处理，处理1：不接种任何菌种，只

异明显。半裸镰刀菌在正常生长下，菌体为黄白

色，菌丝茂密，当与拮抗菌共同生长时，受拮抗菌影

响,菌体颜色加深，而拮抗菌生长饱满,具有良好的拮

处理灭菌水为对照（CK）；处理2：单独接种半裸镰

刀病菌（F）；处理3：接种生防菌Y+6后接种半裸镰

刀病菌（Y+6）；处理4：接种生防菌7后接种半裸镰

刀病菌（7）；处理5：接种生防菌Y+8后接种半裸镰

刀病菌（Y+8）；处理6：接种生防菌10+8-20后接种

半裸镰刀病菌（10+8-20）；每个处理3次重复，每个

抗效果，且拮抗菌Y+6平板对峙试验中出现明显的

抑菌圈（图1,见241页）。经过复筛后得到拮抗效果

强且稳定的4种细菌:Y+6、7、Y+8、10+8-20,其抑菌率

分别为

89.33%

.85.87%

.83.55%、85%~87%（表

1）。2.2拮抗菌的防病盆栽试验重复15株高粱。接菌方式为灌根处理（10

ml）:病

原菌接菌采用半裸镰刀病原菌抱子悬浮液（1X108

cfu

-

mL-1），生防菌采用生防菌菌液（OD600

=

0.7）。

将平板对峙试验筛选出来的拮抗菌进行盆栽

接菌试验,结果表明只接种病原菌的高粱植株（CK）

于高粱4片真叶时,CK与F处理采用蒸馏水灌根,

其他4个处理分别接菌对应的生防菌,于生防菌接

菌7d后，进行病原菌接菌，其中F只接种病原菌，其

他4个处理同时接种生防菌与病原菌，发病后调查

发病率与病情指数［10］o病情指数=100xY（各级病叶数X各级代表

值）/（调查总叶数X最高级代表值）发病率（%）=（染病株数/调查总株数）X1001.2.4

植物细胞活性及活性氧检测

H2O2采用

DAB染色方法,ROS采用NBT染色方法，具体参考

吴颖静等方法［11］,

Evans

Blue染色参考刘楠等

方法［12］O1.2.5

防御酶活性测定

PAL活性参照He等方

法，采用苯丙氨酸检测方法，测定OD290吸光值［12］o

PPO活性参照He等方法，采用邻苯二酚方法，测定

OD398

吸光值［13］o1.2.6

抗氧化酶活性测定

0.5

g高粱叶片50

mol

-L-1用预冷PBS缓冲溶液研磨成匀浆，12

000

r

-min-1

,4T离心20

min,上清液即为抗氧化酶的粗酶

液。SOD酶活性测定采用氮蓝四唑法［14］,POD酶

活性采用愈创木酚法，CAT、APX酶活性测定参照

Zhang等的方法［15］o1.2.7

土壤酶活性测定高粱根际土样收集利用

抖落法取土，土壤脲酶、磷酸酶、多酚氧化酶、纤维

素酶参照关松荫土壤酶测定方法，分别采用比色

法、磷酸苯二钠比色法、邻苯三酚比色法、硝基水杨

酸法测定［16］。1.2.8

数据与分析

采用

Microsoft

Excel（2016

版）、

mega

分析试验数据，采用origin

75制作图表。2结果与分析2.1拮抗菌的筛选从33种细菌中筛选获得17种细菌对半裸镰刀

菌具有较好抑制效果的菌株，其抑菌率均M60%,并

且病原菌菌丝体生长状态、颜色、形态均与对照差

在接菌3天后开始发生枯萎现象，而接种拮抗菌对

枯萎病的发生有明显的抑制效果，仅叶片有少许病

斑，高粱仍然能够正常生长。其中接种拮抗菌Y

+

8.7.10+8-20.Y+6的拮抗效果比较明显，通过高粱

枯萎病的发病率与病情指数调查发现其发病率分

别为

37.93%

.30.77%

.30.77%和

42.33%,病情指数

分别为16.92.30.77.22.12和18.97,显著低于对照

及其他处理，其具体病情指数与发病率详见表2o

由表2可知,Y+8、7、10+8-20、Y+6这4种拮抗菌接

菌对高粱枯萎病的发生具有良好的抑制效果。2.3菌种分子鉴定以上述筛选出的生防效果良好的4种菌株为样

本，通过测序获得的16SrDNA序列，通过NCBI网站

进行Blast序列比对并构建系统发育树，如图2o序

表1拮抗菌株的抑制率Table

1

The

inhibition

rate

of

bio-control

bacteria菌种抑菌率/%菌种抑菌率/%菌种抑菌率/%StrainInhibition ratioStrainInhibition

ratioStrainInhibition

ratioCK975.56±2.33b10+8-2462.22±1.56dY+883.55±0.97a20+6-573.33±0.85b10+5-660.28±0.34d785.87±1.13a2-173.33±1.93b10+8-160.00±0.48d10+8-2085.67±2.11a10+7-272.22±0.66b10+5-260.00±0.48dY+689.33±0.32a1568.89±0.55cA560.00±0.48d10+5-2177.78±0.67b10+5-1466.67±0.84c1460.00±0.48d注:不同小写字母表示各菌种间在5%水平显著差异。Note:

Different

lowercase

letter

indecate

significant

difference

within

species

at

5%

level.表2拮抗菌株防治高粱的盆栽试验Table

2

Potted

experiment

of

controlling

sorghum

with

antagonistic

strain菌种

病情指数发病率Disease

Disease/%

菌种

病情指数发病率Disease

Disease/%

Strainindex incidenceStrainindex incidenceY+818.97±0.24d37.93±0.88f15

50.00±0.67a

60.87±0.67c722.12±0.44d30.77±0.33g10+5-14

32.18±0.34c

55.17±1.67d10+8-2030.77±0.53c30.77±0.33g10+8-24

37.50±0.88c

62.50±0.43cY+616.92±1.38d42.33±0.97e10+5-6

34.44±01.23c

53.33±1.57d10+5-2144.23±0.96b76.92±0.36b10+8-1

42.00±0.59b76.00±1.45b947.50±0.88b79.17±0.13a10+5-2

51.39±0.44a83.33±0.97a20+6-550.00±0.67a60.87±0.67cA551.39±0.44a83.33±0.97a2-152.56±0.33a80.77±1.34a1447.50±0.88b79.17±0.13a10+7-232.14±0.56c42.86±0.97e病原菌

F

50.19±0.21a

85.69±0.88a

240干旱地区农业研究KJ524515短小芽抱杆菌BF17

16S核糖体RNA基因部分序列KJ524515

Bacillus

pumilus

strain

BF17 16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequence7FJ237277短小芽抱杆菌XJAS-ZB-28

16S核糖体RNA基因部分序列FJ237277

Bacillus

pumilus

strain

XJAS-ZB-28

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceMF062612短小芽抱杆菌10A-B92

16S核糖体RNA基因部分序列MF062612

Bacillus

pumilus

strain

10A-B92

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceMF062610短小芽抱杆菌10A-B6

16S核糖体RNA基因部分序列MF062610

Bacillus

pumilus strain

10A-B6

16S

ribosomal

RNA

gene

partialsequenceHQ696430沙福芽抱杆菌KTT-12

16S核糖体RNA基因部分序列HQ696430

Bacillus

safensis strain

KTT-12

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceKT981882短小芽抱杆菌SuaedaB-006

16S核糖体RNA基因部分序列KT981882

Bacillus

pumilus

strain

Suaeda

B-006

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceJF411291沙福芽抱杆菌M40

16S核糖体RNA基因部分序列JF411291

Bacillus

safensis

strain

M40 16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceKF641806短小芽抱杆菌Y13

16S核糖体RNA基因部分序列KF641806

Bacillus

pumilus

strain

Y13

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequence7细菌系统发育树

7 bacterial

phylogenetic

treeGU726983污水菌属富集培养克隆SANR18

16S核糖体RNA基因部分序列GU726983 Defluvibacter

sp.

enrichment

culture

clone

SANRI

8

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceGU726982污水菌属富集培养克隆SANR

1

7

16S核糖体RNA基因部分序列GU726982

Defluvibacter

sp.

enrichment

culture

clone

SANR17 16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceGU726980污水菌属富集培养克隆SANR

15 16S核糖体RNA基因部分序列GU726980

Defluvibacter

sp.

enrichment culture

clone

SANR15 16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceGU726979污水菌属富集培养克隆SANR

14

16S核糖体RNA基因部分序列GU726979

Defluvibacler

sp.

enrichment culture

clone

SANRI4

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequence

KP318076水微生物MB4

16S核糖体RNA基因部分序列KP318076

Aquamicrobium

sp. MB4

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceEU024388未培养细菌克隆菌株WB11

16S核糖体RNA基因部分序列EU024388

Uncultured

bacterium

clone

WBI1

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceLN881594水微生物SN11

16S核糖体RNA基因部分序列Aquamicrobium

sp.

SN11

partial

16S

rRNAgene

strain

SN11NR

025312水微生物菌株SI

16S核糖体RNA基因部分序列NR

025312

Aquamicrobium

lusatiense

strain

SI

16S

ribosomal

RNApartial

sequenceY+6Y+6细菌系统发育树

Y+6

bacterial

phylogenetic

treeMF041848短波单胞菌LTPG10

16S核糖体RNA基因部分序列MF041848

Brevundimonas

sp.

strain

LTPG10 16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceMF405110短波单胞菌Brt-G

16S核糖体RNA基因部分序列MF405110

Brevundimonas

sp. strain

Brt-G 16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceJF833704未培养波单胞菌克隆C174

16S核糖体RNA基因部分序列JF833704

Uncultured

Brevundimonas

sp.

clone

C172

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceAB680017缺陷短波单胞菌基因NBRC3140

16S核糖体RNA基因部分序列AB680017

Brevundimonas

diminuta

gene

for

16S

rRNA

parti

al

sequence

strain

NBRC 3140MH458892短波单胞菌LTPG10

16S核糖体RNA基因部分序列MH458892

Brevundimonas

olei

strain

Prd2

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceLN833472短波单胞菌TN40

16S核糖体RNA基因部分序列LN833472

Brevundimonas

sp.

TN40

partial

16S

rRNA

gene

strain

TN40LC507944缺陷短波单胞菌基因JCM13047

16S核糖体RNA基因部分序列LC507944

Brevundimonas

diminuta

JCM

13047

gene

for

16S

rRNApartial

sequenceKJ000772短波单胞菌基因SCU-B77

16S核糖体RNA基因部分序列KJ000772

Brevimdimonas sp.

SCU-B77

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceY+8Y+8细菌系统发育树

Y+8

bacterial

phylogenetic

treeFJ373035芽抱杆菌S5-1

16S核糖体RNA基因部分序列FJ373035

Bacillus

sp.

S5-1

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceKC200015芽范杆菌NO16

16S核糖体RNA基因部分序列KC200015

Bacillus

sp.

NO16

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequence10+8—20MH569442细菌菌株Glm6

16S核糖体RNA基因部分序列MH569442

Bacterium

strain

Glm6

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceMK100762环太芽抱杆菌SI

16S核糖体RNA基因部分序列MK100762

Bacillus

circulans

strain

SI

16S

ribosomal

RNApartial

sequenceMH569422芽砲杆菌Glm6

16S核糖体RNA基因部分序列MH569422

Bacillus

sp.

(in:

Bacteria)

strain

Glm6

16S

ribosomal

RNAgene

partial

sequenceKM349203环太芽抱杆菌199Cul6S核糖体RNA基因部分序列KM349203

Bacillus

circulans

strain

199Cu

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceKM349207芽范杆菌210Zn-As

16S核糖体RNA基因部分序列KM349207

Bacillus

sp.

21

OZn-As

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceKM349200环太芽抱杆菌194Fel6S核糖体RNA基因部分序列KM349200

Bacillus

circulans

strain

194Fe

16S

ribosomal

RNAgene

partial

sequenceKM349205芽抱杆菌206Fe-As 16S核糖体RNA基因部分序列KM349205

Bacillus

sp.

206Fe-As

16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequenceMK823865细菌菌株BS0677

16S核糖体RNA基因部分序列MK823865

Bacterium

strain

BS0677 16S

ribosomal

RNA

gene

partial

sequence第39卷Fig.2图2

4种拮抗细菌系统发育树Phylogenetic

trees

of

4

bio-control

bacteria列对比发现Y+8与短波单胞菌(Brevundimonas

)的一

但仍高于空白对照,这表明生防菌接菌进一步诱导

致性达到100%,7和10+8-20与芽抱杆菌(Bacillus)

了比。2信号,但总体上降低了超氧阴离子含量,避

免其过量积累造成植株氧化胁迫损伤。DAB染色

结果发现,在接种生防菌后的高粱叶片比。2分布显

著多于单独接种病原菌的高粱叶片。而NBT染色

说明接种生防菌的高粱超氧阴离子含量及分布明

的一致性达到

99%

,Y+6

与

Aquamicrobium

达到

98%,

通过系统发育树鉴定,Y+8为短波单胞菌、7为短小芽

抱杆菌、10+8-20为芽抱杆菌、Y+6为Aquamicrobium。2.4生防菌接菌对高粱叶片活性氧的影响如图3可知，单独接种病原菌后O2和比。2含

显比单独接种病原菌的高粱叶片少。经Evans

Blue

量均显著高于未接菌的对照(CK)，并且接种生防菌

后其植株的比。2含量显著高于单独接种病原菌的

植株，而O一含量显著低于单独接种病原菌的植株，

染色还发现接种生防菌的高粱叶片的死细胞明显

少于单独接种病原菌的高粱叶片，说明接种生防菌

能够有效减少高粱叶片受到的损伤。

第3期马文旭等:高粱枯萎病生防菌株筛选研究2412.5生防菌接菌对高粱防御酶的影响活性分别提咼了

0.024,0.115,0.138,0.144,0.137

U

如图5可知,病原菌接菌后（多酚氧化酶）高粱

・g-1・min-1,其中生防菌7、Y

+

8、10

+

8-20三者之

间无明显差异;PAL分别提高了

0.227,0.32,0.553,

0.207,0.453

U

-

g-1,其中生防菌

7

和

10+8-20

接菌

叶片的防御酶PAL（苯丙氨酸解氨酶）与PPO（多酚

氧化酶）活性均显著高于空白对照植株，且经生防

菌Y+6、7、Y+8、10+8-20和病原菌接菌的高粱PPO

的植株叶片PAL活性受到明显的诱导，与单独病原

菌处理间差异达显著性水平，而Y

+

6,Y

+

8处理与

酶的活性均显著高于单独病原菌接菌植株。如图5

所示,F、Y+6、7、Y+8、10+8-20处理的PPO防御酶

病原菌单独处理的高粱植株之间无显著差异。CK10+8-2010+5-21920+6-52-110+7-2图1抑菌率超过70%的拮抗菌Fig.1

Bio-control

bacteria

with

inhibitory

rate

over

70%1401200o

8o

6o

4o

2o

b

tt*、「

•oluu)b

ttb壬

•oUIUMO.2.0HJO

L5d(一」

•、fcsKEMB^Mr栄Tuwmu£UI

L0

fl^

cq5HO.

0JU3JUOO0CK

F

Y+6

7

Y+8

10+8-20CKY+67 Y+8

10+8-20图3不同处理对高粱O；和H2O2含量的影响Fig.3

Effects

of

different

treatments

on

the

content

of

O-

and

H2O2

in

sorghum图4不同处理对高粱叶片染色情况Fig.4

Coloration

of

sorghum

leaves

under

different

treatments(-『•

n)±L.O.8.6O..4O..2OO.

0.图5不同处理对高粱防御酶活性的影响Fig.5

Effects

of

different

treatments

on

sorghum

defense

enzyme

activity•n)宝史BMM盍怖

242干旱地区农业研究第39卷2.6生防菌接菌对高粱抗氧化酶的影响著降低，均显著低于单独的病原菌接菌植株，恢复

通过测定高粱发病后抗氧化酶.

的活性，如图6可知，与空白对照相比，病

至空白对照水平。其中单独病原菌接菌高粱的POD

酶活性相比较CK提高了

9

U・g-1,生防菌接菌高粱

原菌接菌后植株的各抗氧化酶活性均显著升高,且

4种生防菌接菌后,各处理植株的POD酶活性均显

分别提高了

62.44.36.51.108.29.65.88

U

-

g-1。2.7生防菌对高粱根际土壤酶活性的影响著高于单独的病原菌接种植株。与单独病原菌接

本试验通过测定土壤脲酶、磷酸酶、多酚氧化

种植株相比,生防菌Y

+

6.7.10

+

8-20接菌植株的

SOD与APX酶活性也显著提高。而CAT酶活性显

(一『n・)3七

封应

酶、纤维素酶的酶活性来探讨不同生防菌对高粱根

际土壤的影响，由图7可知，与空白对照相比,接菌aab

壬G

・bo(Tq

・旦/

封一应奩AEexdvxdvCK

FY+6

7

Y+8

a10+8-200CK

F

Y+6

7

Y+8

10+8-20(一『n・)3七

封应50壬b

454035b

壬壬3025AEeGode

TTGOS壬d20总血1510God(Tq・G・bo目/封应3

2

1

4

GOS50CK

F

Y+6

7

Y+8 10+8-20CK

F

Y+6

7

Y+8

10

+

8-20图6不同处理对高粱抗氧化酶活性的影响Fig.6

Effects

of

different

treatments

on

antioxidant

enzyme

activities

of

sorghumCd壬壬(一『4七二

目s4

3

2

1

血BB^^B

AArQeuseleqdsoqdCK

F

Y+6

1.50bthoe

7

Y+8 10+8-200.25

rF

Y+6

7

Y+8

10+8-20「(1・『二b20

15>usep

b壬旦封应/B^MeoSEInBlooM

0.

0.0.100.

05xoouuqdAIOd0幣忠CKFY+6

7

Y+8

10+8-200CKFY+67Y+8

10+8-20图7不同处理对高粱土壤酶活性的影响Fig.7

Effects

of

different

treatments

on

the

enzyme activity

of

sorghum

soil

第3期马文旭等:高粱枯萎病生防菌株筛选研究243病原菌后高粱根际土壤的4种土壤酶活性均显著升

立枯病菌等枯萎病的发生［l9］o另外，李新等［20］通

过黄瓜枯萎病的研究也发现POD、SOD活性的变化

与黄瓜的抗病性呈正相关关系，侯茜［21］、孙正祥［22］

等对西瓜枯萎病的研究还发现,POD和CAT活性与

咼，且接菌生防菌Y

+

6、7、Y

+

8、10

+

8-20后4种土

壤酶活性显著高于单独接种病原菌的植株根际土

壤酶活性。其中Y+8处理的土壤脲酶活性最高，且

显著高于其他生防菌处理，10

+

8-20处理的根际土

植物的抗病性呈正相关，

这与本试验结果类似。

另

壤磷酸酶活性显著高于其他生防菌处理,7处理的

根际土壤纤维素酶活性显著高于其他各生防菌处

理，而多酚氧化酶在各生防菌处理之间差异未达显

外,Xu等［23］关于花生白叶枯萎病的研究也发现,短

小芽抱杆菌对枯萎病有显著的抑菌活性，在田间试

验中达到65%以上，具有较好的生防作用。已有研究表明,PAL和PPO活性可以作为反应

植物抗病能力的主要生理指标，其中PPO可合成醌

著性水平。3讨论本试验分离鉴定出4株对高粱枯萎病有明显拮

抗效果的生防细菌(Aquamicrobium)、短小芽抱杆菌

(Bacillus)、短波单胞菌(Brevundimonas

)、芽抱杆菌

(Bacillus)，并且通过调控高粱植株的抗氧化系统、

防御酶系统以及高粱根际土壤酶活性等变化有效

地抑制半裸镰刀菌的生长及高粱枯萎病的发生。

本研究筛选的4株拮抗细菌均能够诱导高粱H2O2

的产生，激活抗氧化系统,增强抗氧化酶SOD、POD、

CAT、APX活性以清除过量的活性氧,避免活性氧过

度积累对植物造成损伤。刘丽霞等［17］关于拟南芥

h2o2对大丽花黄萎病的早期防御反应的研究也表

明,在植物病原体的向化作用下，活性氧有着多方

面的作用，其不仅可激发植物的抗病系统,而且可

诱导抗氧化酶活性的提高,清除活性氧，避免植株

受到氧化胁迫损伤。除此之外,本试验还发现4种拮抗细菌在抑制

高粱枯萎病发生的同时均能显著提高其根际土壤

的土壤酶活性，有助于良好的高粱根际土壤微生态

环境的形成，为高粱生长创造更适宜的土壤环境条

件。闫杨等［18］针对3株黄瓜枯萎病生防菌一芽

抱杆菌的研究也发现生防菌的施入能够明显地提

高黄瓜根际土壤磷酸酶、过氧化氢酶、脲酶等活性。

本试验施入4种生防菌后,高粱根际土壤的脲酶、磷

酸酶、多酚氧化酶、纤维素酶的酶活性均有显著的

提高，与闫杨等的研究结果类似，说明生防菌还能

通过提高土壤酶活性增强土壤肥力实现其防病促

生作用。在本试验的相关研究中，4种生防菌株均能够

有效地提高抗氧化酶活性，很好地避免了活性氧的

过量积累。其中“7”短小芽抱杆菌(Bacillus)与“10

+

8-20”芽抱杆菌(Bacillus

)对植株抗氧化酶活性的

促进效果与对枯萎病的生防效果最为明显。

也有

研究发现，芽抱杆菌可对多种病害起到生防作用，

其可有效抑制西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、黄瓜

类物质使病原菌发生钝化，在植物受到病原菌侵害

时发挥着重要的作用［24］o另有黄瓜枯萎病的生物

防治相关研究发现,接种芽抱杆菌后植株PAL、PPO

酶活性显著提高，促进了植物的生长和植物抗逆性

的增强［9］o本试验也发现，与单独植物病原菌侵染

相比,生防菌接种后植株的PAL、PPO酶活性均有

显著的提高，有助于高粱枯萎病抗性的增强。4

结

论本研究通过拮抗细菌与半裸镰刀菌的拮抗试

验与接菌试验，筛选并鉴定出

4

种拮抗细菌对半裸

枯萎病有良好的生防效果，分别是Aquamicrobium

；

短小芽抱杆菌(Bacillus

)、短波单胞菌(Brevundi­monas

)、芽抱杆菌(Bacillus

),并且通过盆栽试验证

明,4种生防菌可以有效地抑制高粱枯萎病的发生,

提高植株胁迫抗性，

诱导植物产生防御反应并增强

植株根际土壤酶活性来提高植物抗病性，

从而有效

控制高粱枯萎病的发生，

在高粱枯萎病的生物防治

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335-338.“西北典型农区高效节水灌溉技术与集成应用”项目下设课题验收

工作会议在西北农林科技大学召开2021年5月8日至10日，由中国旱区节水农业研究院蔡焕杰教授主持的“十三五”国家重点研发计划

“西北典型农区高效节水灌溉技术与集成应用”项目下设课题验收工作会议在西北农林科技大学召开。副

校长房玉林出席会议并致开幕词。验收专家组由中国农业大学康绍忠院士任组长，中国水利水电科学研究院许迪教授级高工、宁夏大学

田军仓教授、清华大学杨大文教授、东北农业大学付强教授、中国农业科学院农田灌溉研究所黄修桥研究

员、西安理工大学王全九教授以及扬州大学冯绍元教授为验收专家组成员，对课题评审验收。项目主持及

参加单位西北农林科技大学、江苏大学、武汉大学、内蒙古农业大学、宁夏回族自治区水利科学研究院、中国

农业大学、中国农业科学院农田灌溉研究所等80余人参加会议。“西北典型农区高效节水灌溉技术与集成应用”项目由西北农林科技大学牵头，中国农业大学、武汉大

学、江苏大学、中国农业科学院农田灌溉研究所、内蒙古农业大学、宁夏回族自治区水利科学研究院等20家

单位参与。项目以“机理识别-技术创新-设备研发-集成应用”为主线，共设置8个课题，其中1个应用基础

研究课题,2个关键技术与产品研发课题,5个区域技术集成与示范应用课题。项目针对西北典型农区干旱

缺水与生态环境脆弱并存、农业用水浪费严重、主要粮油作物和经济作物水分利用效率较低的实际，以提高

作物水分利用效率和降低农业用水总量为目标，按照应用基础研究、关键技术与产品研发、区域技术集成与

示范应用科技创新链条,重点研究作物高效用水机理与调控，研发绿色高效节水灌溉装备和灌溉输配水系

统与田间工程关键技术,在陕西、甘肃、宁夏、新疆、内蒙等省(区)建立具有区域特色的节水灌溉技术试验示

范区，进行技术集成与示范应用，建立不同区域典型作物节水灌溉制度,提出节水灌溉系统技术解决方案与

标准体系,形成相应高效节水灌溉技术模式,推动西北地区全面实施规模化高效节水灌溉行动,提升节水灌

溉领域自主创新能力。专家组对各课题的完成情况给予高度肯定,也为后续项目整体验收工作给出了切实有效的建议。项目主持人蔡焕杰教授表示，项目组将结合专家组提出的意见对项目及各个课题研究工作进行全面梳

理和总结，后期将搭建系统性的项目验收材料框架，进一步凝练各个课题的创新性成果，凸显本项目的成果

特色，确保项目顺利通过整体验收。

(牛秀峰，沐

青)