卵巢癌患者腹水中MDSCs通过靶向VASP促进卵巢癌干细胞表型及细胞增殖

中国计划生育和妇产科2020年第12卷第12期.39 •论著与临床卵巢癌患者腹水中MDSCs通过靶向VASP促进

卵巢癌干细胞表型及细胞增殖李莉"，沙静2基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（项目编号:2016D01C363)作者单位:1.830011新疆乌鲁木齐，新疆医科大学附属肿瘤医院妇外一科;2. 830002新疆乌鲁木齐，新疆生产建设兵团医院妇科作者简介:李莉，毕业于新疆医科大学，硕士研究生，主任医师，主要研究方向为卵巢恶性肿瘤的诊治

* 通讯作者，E-mai丨：*******************【摘要】目的探究印巢癌腹水中健系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)对SKOV 3

细胞的影响及机制。方法取20例卵巢癌患者的腹水，使用磁珠分选的技术分离腹水中MDSCs细胞，并用流

式细胞术鉴定CD 33和CD 11丨）的表达；将SK0V 3细胞分别与磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS)和MDSCs上清共孵育，qPCR和Western hl<，t检测孵育后SKOV 3细胞干性指标的表达，以及血管扩张刺

激罐蛋白（vasodilator stimulated phosphoprotein,VASP)的表达，CCK 8检测细胞增?直能力的变化；体外抑制

SK0V 3细胞VASP表达的同时与MDSCs细胞上清孵育，检测细胞干性的变化以及细胞增殖能力的变化。结果采用磁珠分选的MDSCs表达CD 33和CD 11 b,符合MDSCs的特征;将SK0V 3细胞与MDSCs上清共

孵育后细胞干性指标CD

44、NAN0G、0CTW表达上调（P

<0. 001)，VASP表达亦上调（P

<

0.001),细胞增殖显

著增加（/><0. 05);抑制VASP表达后，MDSCs上清对SK0V 3细胞干性及增殖能力的影响被逆转。结论卵

巢癌腹水中MDSCs能够调控VASP的表达而影响SK0V 3细胞干性和增殖。【关键词】卵巢癌腹水；MDSCs;VASP;细胞干性【中图分类号】R 737. 31

【文献标志码】A

【文章编号】16744020 (2020) 12>0394)5doi：10. 3969/j. issn. 1674^020. 2020. 12. 10Ovarian cancer ascites MDSCs targeted VASP promotes phenotype and

proliferation of SKOV 3 stem cellsU U,'' ,SHA Jing21.

Department of Gynecological Surgery., Cancer Hospital of Xinjiang Medical Universityf Vrumqi Xinjiang 830011 , P.

R. China；2.

Department of Gynecology y Xinjiang Corps Hospital ^Urumqi Xinjiang 830002, P.

R. China

*

Corresponding au//ior. E-mail ： donghui555@ sina. com[Abstract】 Objective

To investigate the effect and mechanism of MDSCs on ascites in ovarian cancer on SKOV 3 cells.

Methods

Ascites from 20 ovarian cancer patients were collected, and MDSCs were isolated using magnetic bead sorting technology,

and the expression of CD 33 and CD 1 1 h were identified by flow cytometry. SKOV 3 cells were co-incubated with PBS and MDSCs

supernatants, and qPCR was performed. Western blot was used to detect the expression of SKOV 3 cell dryness index and VASP

expression, and CCK 8 was used to detect the change of cell proliferation ability. In vitro inhibition of SKOV 3 cell VASP expression

was incubated with the supernatant of MDSCs to detect changes in cell dryness and cells Changes in proliferative capacity.

Results

The magnetic beads sorted MDSCs expressed CD 33 and CD

11

h, which accorded with the characteristics of MDSCs. After

co-incubation of SKOV 3 cells with the supernatant of MDSCs , the expression of CD 44, NANOG and OCT-4 were up-regulated

(P <

• 40 •CHINESE JOURNAL OF FAMILY PLANNING & GYNECOTOKOLOGY Volume 12 Number 12 20200. 001) , and VASP was expressed. It was also up-regulated ( P <0. 001) , and the cell proliferation was significantly increased

(P <

0. 05). After inhibiting the expression of VASP, the effect of MDSCs supernatant on the sternness and proliferation ability of SKOV 3

cells was reversed.

Conclusion

MDSCs in ovarian cancer ascites can regulate the expression of VASP and affect the sternness and

proliferation of SKOV 3 cells.【Key words】ovarian cancer ascites; MDSCs; VASP; cell sternness卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其病死率

在所有妇科肿瘤中最高，5年生存率徘徊在30%〜

40%,全世界每年死亡人数达到64 500人⑴，由于其早

得细胞沉淀用STEMCELL缓冲液重悬，根据说明书，使

用磁珠分选MDSCs,具体步骤为，取丨mL上述细胞悬

液，转移至磁珠分选专用试管，并且于磁珠分选专用试

期缺乏特异性症状和体征，初诊者中70%的病例已属晚

期，导致手术无法获得满意的减瘤效果，不能彻底切除

病灶，远处转移更是手术本身无法解决[24]。目前，由于

对卵巢癌的起源、发病机理和转移复发等领域的认识不

足，导致对卵巢癌早期诊断和有效治疗方法的探索受到

极大限制[5]。卵巢癌的一个非常重要的特点是腹水形

成以及伴随腹水的盆腹腔脏器广泛播散性转移，晚期患

者的肿瘤甚至可以到达肝脏表面和膈肌顶部[6]。髓系

来源抑制细胞（myeloid-derived

suppressor

cells,

MDSCs)

是造血干细胞向髓系分化时产生的一群高度异质性的

不成熟的髓系细胞，在正常情况下体内比例极低，而在

肿瘤和其他慢性炎症的情况下，MDSCs可以在骨髓、脾

脏以及炎症部位等处大M聚集，通过多种机制发挥免疫

抑制作用。MDSCs可以抑制机体免疫细胞发挥正常的

免疫功能，使免疫细胞处于无应答或者耐受的状态，失

去对肿瘤细胞的杀伤和清除能力[~。本文探究了卵巢

癌患者腹水中MDSCs对SKOV 3细胞干性的影响，旨在

为卵巢癌的研究提供帮助。1材料与方法

1.1材料20例卵巢癌患者腹水样本（来自新疆医科大学附属

肿瘤医院，并取得患者知情同意及伦理委员会批准）；卵

巢癌细胞株SKOV 3(购自中国科学院上海细胞库）；

IgGl-FITC、CD 33-FITC、CD 11-FITC、CD 14-FITC 抗体

(购自福麦斯生物技术有限公司）；cDNA合成试剂盒、

qPCR反应试剂盒（购自天根生化科技有限公司）；

MDSCs分选磁珠（购自福麦斯生物技术有限公司）；血

管扩张刺激憐蛋白（vasodilator

stimulated

phosphoprotein,

VASP)、CD 44、NAN0G、0CT*4、GAPDH —抗（购自武汉

三鹰生物技术有限公司）；流式细胞仪（Beckman公司）。

1.2细胞培养取液氮保存的SKOV 3细胞，于37^水浴锅中迅速

解冻，加人等体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基

稀释,1 000

g离心5

min,细胞沉淀重悬后接种于细胞培

养皿中，隔天更换培养基，细胞生长至汇合率达80%时

消化传代。1.3

MDSCs取10

mL卵巢癌患者腹水，1 000

rpm离心5

min,获管中加人5〇

pL的胎牛血清和50

jiL

Neutrophil

Enrichment

Cocktail 溶液混匀后 2 ~81 孵育 15

min,然

后补充缓冲液至试管装满,300

g离心10

min,弃上清；

然后加1

mL缓冲液重悬细胞，加入50

(xL

Biotin

Selection

Cocktail,混合均匀后于4弋条件下孵育15

min,

加人150

pX

Magnetic

Particles混匀后24条件下孵育

10

min,加缓冲液至2_ 5

mL，混匀后将试管放人磁极中，

5

min后将负选液转移至新的试管中，细胞计数，调整细

胞数约为 1

x

lOVmL，加人 5

jjlL

FcR

Blocker 及 4

pL

FITC-anti-CD33,混匀后室温孵育15

min,然后加人

5〇

jjlL

PE

Selection

Cocktail，室温孵育 15

min，再加人

25 |j_L

Magnet

Nanoparticles 溶液，室温孵育 10

min,补充

缓冲液至总体积2.5

mL，混勻后放人磁极中5

min,弃掉

试管内液体，再次加人缓冲液至2.5

mL,混匀后再先后

2次放人磁极中5

min,弃掉试管内液体，得到CD 33 +

CD 11

b+的

MDSCs 细胞。1. 4流式细胞术鉴定CD 33 +

CD 11

b+

MDSCs采用流式细胞术鉴定MDSCs标志物，具体步骤为：

调整提取到的细胞密度为1

x 107个/mL,将细胞分为

4组，每组3个微量离心管，每管700

pL细胞，每组细胞

分别加入 5

(xL

IgGl-FlTC、CD 33-FITC、CD 11

b-FITC、

CD 14-FITC抗体室温避光共孵育20

min,用PBS溶液洗

涤2次，使用流式细胞仪检测表面标志物表达，应用

Flow】。7. 6. 1软件分析结果。1.5

siRNA 转染取SKOV 3细胞接种于6孔板中，每孔细胞数为

1

x 105,根据转染试剂盒说明书，将siRNA、negative

C〇mr〇l(siNC)与转染试剂混合，然后在不含胎牛血清的

DMEM培养基中与MDSCs共孵育8

h,再用完全培养基

培养24

h,所得细胞进行后续实验。1.6

qRT-PCR培养各组细胞至密度为80%,消化细胞至离心管

中，加人Trizol裂解5

min,取上述细胞裂解液加人

2〇〇(xL氯仿，静置5

min后，于丨0 360

rpm，4t离心

15

min,转移上层水相，加人500 (iL异丙醇,10 360

rpm，

离心10

min,去上清，丨mL 75%乙醇清洗RNA沉淀

后,20 |jlL

RNA-free水重悬RNA沉淀，55丈水浴10

min,

即为总RNA，使用核酸定量仪检测总RNA含量。根据

cDNA

Synthesis试剂盒指示配置反应体系，将提取的

中国计划生育和妇产科2020年第12卷第12期• 41 •SKOV 3细胞RNA逆转为cDNA,然后利用核酸定量仪

对cDNA进行定量。然后根据qPCR试剂盒指示配置反

应体系，进行qPCR反应，采用GAPDH作为内参，反应

后采用2

表1名称CD 44NANOGOCTAGAPDH剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸人发光液中反

应半分钟，曝光并拍照，用Image

j软件对曝光结果进行

定量分析。1.9统计学分析法计算基因表达水平。引物序列见表1。CD 44、NAN0G、0CT4、GAPDH 引物序列引物序列F： ACCCCATCCCAGACGAAGACAGTC

R ： GGGATGAAGGTCCTGCTTTCCGF： GCAAAAAAGGAAGACAAGGTCC

R： CCTTCTGCGTCACACCATTGF： CGAAGAGAAAGCGAACCAGTATC

R： AGAACCACACTGGACCACATCF： GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA

R： CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAAATG采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所有数据以

*±s表示，多组间差异使用方差分析（one-way

AN0VA),两组间比较采用LSD法，P <0.05为差异有统计学意义。2结果2. 1

CD 33+

CD 11

b +

MDSCs 鉴定结果使用磁珠分选出MDMDSCsSCs后，使用流式细胞术鉴定

标志蛋白，结果（图1)显示：磁珠分选出的

MDSCs CD

33 表达水平为（99. 2 ±

1.

8)%，CD 11

b 的表

1.7细胞增殖达水平为（98. 2 ±2.1 )%,

CD 14表达水平为（3.3 ±

0.7) %,CD

33 和

CD 11

b 为

MDSCs

的标志蛋白，CD 14

不表达于MDSCs,所以本文采用磁珠分选出的细胞为

MDSCs,可用于后续实验。取各组SKOV

3细胞，用不含抗生素的DMEM完全

培养基稀释至3

x

104个/mL，96孔板每孔加人100

pL

上述细胞稀释液，每组设置5个复孔，并且设置24

h、

48

h、72 h时间梯度，按相同的方法平行接种3块相同的

96孔板;然后将3块96孔板放置在培养箱中培养，分别

于24

h、48 h、72 h后取出对应的96孔板，避光向每孔中加

入10

jjlL的CCK-8试剂，继续在培养箱中培养2

h，然后使

用酶标仪在450

nm波长处检测每孔的吸光度。以空白组

吸光度为背景值,OD值越大表示细胞增殖能力越强。1. 8 Western blot2. 2卵巢癌患者腹水MDSCs促进SKOV 3细胞CD 44、

NANOG、OCT4

mRNA 表达为了验证卵巢癌患者腹水MDSCs对SKOV 3细胞干

性的影响，本研究对卵巢癌患者腹水MDSCs培养24

h后，

收集细胞培养上清作为条件培养基（CM),与SKOV 3细

胞共孵育，SK0V 3干性指标CD 44、NANOG、OCM的表

达,qPCR检测结果(下页图2)显示，相比于与PBS共孵育

的SK0V 3细胞，与MDSCs条件培养基共孵育后,SKOV 3

中

CD 44、NANOG、OCT4

mRNA 表达显著上调(P <0.001),

说明卵巢癌患者腹水MDSCs促进SKOV 3细胞干性。2. 3卵巢癌患者腹水MDSCs促进SKOV 3细胞CD 44、

各组取3

x 105个SKOV 3细胞接种于6孔板中，培

养至细胞汇合率达80%时，去除培养基，每孔中加人

120斗的RIPA蛋白裂解液和丨.2 +L的PMSF蛋白酶

抑制剂，于冰上充分裂解30

min,裂解液12 000

rmpjt

离心10

min,取上清，即为细胞总蛋白。BCA蛋白定量

后蛋白加入上样缓冲液后，沸水浴加热变性，然后进行

SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对PVDF

膜封闭2h,然后以1:1 000比例稀释后的VASP、CD44、

NANOG、OCT4、VASP 蛋白表达将MDSCs培养上清作为条件培养基（CM),与SKOV

3共孵育24

h后检测SKOV 3细胞中CD 44、NANOG、

0CT4、VASP蛋白表达,Western

blot检测结果显示，相比

于与PBS共孵育的SKOV 3细胞，与MDSCs条件培养基

共孵育后,SKOV 3中CD 44、NAN0G、0CT4蛋白表达水

平显著上调（P <〇. 〇〇1 )，证明卵巢癌患者腹水MDSCs可NAN0G、0CT4、GAPDH —抗代孵育过夜，TBST洗膜

后二抗室温孵育1. 5

h，再用TBST、洗膜后按照ECL试图1流式细胞术鉴定CD 33+ CD 11 b+ MDSCs

• 42 •CHINESE JOURNAL OF FAMILY PLANNING & GYNECOTOKOLOGY Volume 12 Number 12 2020促进SKOV 3的细胞干性，并且V调VASPASP蛋白表达亦显著上

的同时转染siRNA抑制VASP表达，然后检测细胞干性

变化,qPCR检测结果（图5)显示，转染siVASP后细胞

CD 44、NANOG、OCT4表达显著低于条件培养基共孵育

组（P <0.01)，且与PBS组无显著差异；Western

blot检

测结果（图6)与上述结果一致；说明卵巢癌患者腹水

调(P <0. 001)，提示卵巢癌患者腹水MDSCs或可通过上

的表达而调控卵巢癌的病理过程，详见图3。条件培养基与SKOV 3细胞共孵育后，

MDSCs2.4卵巢癌患者腹水MDSCs促进SKOV 3增殖将CCK 8MDSCs检测细胞增殖，结果（图4)显示，与条件

MDSCs促进SKOV 3细胞VASP表达而增加细胞干性。

2.6卵巢癌患者腹水MDSCs促进SKOV 3细胞VASP

表达而调控细胞增殖培养基共孵育组细胞0D值显著高于PBS组，说明

MDSCs条件培养基能够显著提高SKOV 3增殖能力

能够促进

(P<0.01

)，提示卵巢癌患者腹水MDSCs为了探究VASP能够通过调控细胞干性而调控细胞

SKOV 3细胞干性而促进SKOV 3的增殖能力。2. 5卵巢癌患者腹水MDSCs促进SKOV 3细胞VASP

表达而诱导细胞干性以上研究发现卵巢癌患者腹水MDSCs上清能够诱

导SKOV 3细胞VASP表达的上调和细胞干性的增力口，

为了探究其诱导的VASP表达上调是否与细胞干性的增

加有关，本文在SKOV 3细胞与MDSCs细胞上清共孵育画PBS图2 qPCR检测各组SKOV 3细胞干性

(与PBS组相比，…f <0.001)CD44丨麟鑛丨

ANOG ^

gBi]cmvaspiAPDH图 3 Western blot 检测 CD 44、NANOG、OCT4、VASP

蛋白表达（与PBS组相比P <0.001)60 80图4 CCK8检测MDSCs对SKOV 3增殖能力的影响

(与 PBS 组相比，• P =0. 024, •** 尸 <0. 001)增殖，本文在SKOV 3细胞与MDSCs细胞上清共孵育的

同时转染siRNA抑制VASP表达，然后检测细胞增殖,

CCK 8检测结果（图7)显示，CM +

siVASP组SKOV 3细

胞增殖能力显著低于CM +siNC(P<0.01),且与PBS

组无显著差异。说明卵巢癌腹水MDSCs能通过调控

VASP表达而促进细胞增殖。PBS+siNCCM+siNCCM+siVASPCD44 NANOG OCT-4图5 qPCR检测各组SKOV 3细胞干性

(与 PBS + siNC 组相比，•* P =0. 030, *•’ P <0. 001 )图 6 Western blot 检测 CD 44、_OG、OCT _4、VASP 蛋白表达

(与 PBS + siNC 组相比，** P

=0. 017，*** P

<0.001)22..+siNC

1.0-.L.5-.0.51-

-♦ CM+siNC

S-CM+siVASPU1--I--0

0^2040Time/h图7 CCK8检测VASP对SKOV 3增殖能力的影响

(与 PBS 组相比，••尸=0_ 026, •*. P <0_ 001)

中国计划生育和妇产科2020年第12卷第12期3讨论腹水的形成以及伴随腹水的盆腹腔脏器广泛播散

性转移是卵巢癌发生发展的一个重要的特点，卵巢癌腹

水除了携带脱落肿瘤细胞播散的机械因素外，还可以发

挥肿瘤免疫抑制作用，在卵巢癌腹水可携带多种免疫细

胞，如T细胞、巨噬细胞、髓源抑制细胞等，MDSCs可以

抑制机体免疫细胞发挥正常的免疫功能,使免疫细胞处

于无应答或者耐受的状态,失去对肿瘤细胞的杀伤和清

除能力；另外，还可以通过促进肿瘤血管生成、侵袭和转

移等非免疫机制参与肿瘤的恶性生物学行为~°]。

VASP可表达于肿瘤细胞的细胞膜上，而帮助肿瘤细胞

的生长和转移[IM2],所以本文主要探究了卵巢癌腹水的

MDSCs是否可通过调控卵巢癌细胞表面VASP的表达

而调控其细胞干性和细胞生长。在卵巢癌的相关研究中发现，MDSCs可以在前列腺

素E2的趋化下进人腹水中，发挥免疫抑制作用il3]。另

外，最近有研究报道：MDSCs可以通过miR-101的调控

作用增强卵巢癌的干细胞特性，对卵巢癌患者疾病的进

展以及预后产生了关键的影响[~，说明体内免疫细胞和

肿瘤干细胞在卵巢癌发生和转移中具有非常关键的相

互作用。本文亦研究发现从卵巢癌患者腹水中分离的

MDSCs 能够使

SKOV 3 细胞

CD 44、NAN0G、0CT4

mRNA和蛋白的表达显著增加，SKOV 3细胞干性被提

高，并且细胞增殖能力亦显著增加。VASP是一种重要

的肌动蛋白骨架调节蛋白，主要分布在片状伪足前缘、

丝状伪足尖端和黏附斑等细胞的高运动性区域，可调节

肿瘤的生长、分化、黏附、迁移[15],但是并无研究报道

VASP与肿瘤干性相关，本文研究发现MDSCs能够通过

分泌的作用来调控卵巢癌的细胞干性的同时VASP的表

达上调，并且抑制VASP表达后，MDSCs对SK0V 3细胞

干性的影响被抑制，提示卵巢癌患者腹水中的MDSCs

可能通过分泌作用影响了卵巢癌细胞VASP的表达而促

进了细胞干性。综上所述，卵巢癌患者腹水中MDSCs能够通过分

泌作用调控卵巢癌细胞的细胞干性以及细胞的增殖能

力，其机制可能为上调卵巢癌细胞VASP的表达,但是其

具体的调控机制还需要进一步研究。【参考文献】[1 ] Jemal A, Bray F, Center M M , et al. Global cancer statistics [ J .CA-A Cancer Journal for Clinicians, 2011 , 61(2)： 69-90.[2] Torre L A, Trabert B, Desantis C E, et al. Ovarian cancerstatistics, 2018 [J]. CA-A Cancer Journal for Clinicians, 2018,68(4) ： 284-296.• 43 •[3] Force U T, Grossman D C, Curry S J, et al. Screening for ovariancancer: US preventive services task force recommendationstatement [ J ]. JAMA ： the journal of the American Medical

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