细胞mRNA的提取

技术方法名称 细胞mRNA的提取

基本原理

一个典型的哺乳动物细胞含有约10

-5

ug总RNA，其中80～85%是核糖体RNA（主要

有28S，18S，5.8S和5S四种）。剩余的15～20%中大部分由不同的低相对分子量的RNA

组成（如转运RNA和小核RNA）。这些高丰度的RNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、

密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。相反，占RNA总量1～5%

的信使RNA即mRNA无论大小还是序列都是相异，其长度从几百碱基到几千碱基不等，其

实际含量也随着细胞类型的不同而不同，随细胞生理状态的变化而变化。在单个哺乳动物

细胞中，大约有360,000个mRNA分子，12,000种不同的mRNA分子。有些mRNA在mRNA

群体中的比例约为3%，而其它一些mRNA所占的比例则不超过0.01%。这些稀有或低丰度

mRNA的拷贝数大约是每个细胞5～15个。然而，这些低丰度mRNA有11,000种，占mRNA

群体的45%。

在真核生物中，大部分mRNA（组蛋白除外）都是聚腺苷酸化的，其约200个腺苷酸

残基构成的3’尾部为分离真核mRNA提供了有效的方法。寡聚（dT）可以与poly（A）

尾相结合，被用于回收mRNA。传统方法是将提取的总RNA（用酚-氯仿抽提细胞裂解液）

通过寡聚（dT）纤维素柱来制备。但为了能将核酸酶造成的损伤降至最低，现在常采用一

种更迅速的方法即直接将结合着寡聚（dT）的磁珠加入到细胞裂解液中，再用强磁铁将磁

珠吸出再洗出mRNA。某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物可

以作为mRNA提取的替换途径。

因为核糖残基在2’和3’位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污

染的RNA酶 — 具有水解核糖残基和磷酸间二酯键能力的酶切割。由于RNA酶从裂解的细

胞中释放且存在于皮肤上，故要小心防止玻璃器皿、操作平台以及浮尘中RNA酶的污染。

目前尚无使RNA酶失活的简易办法。链内二硫键的存在使许多RNA酶可抵抗长时间煮沸和

温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新折叠。和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳

离子激活，因此难以被缓冲液中加入的EDTI或其他金属离子螯合剂失活。防止RNA酶最好

的方法就是避免污染。

提取细胞mRNA后，可通过mRNA翻译、凝胶电泳或Northern Blot分析来检测mRNA

的完整性，通过紫外分光光度计来检测mRNA的纯度。

用途及受限因素

■酶学研究 ■cDNA文库构建 ■RT-PCR ■S1核酶分析 ■引物扩增 ■核糖核酸酶保护

■分子杂交 ■体外转录 ■差异显示 ■基因表达分析

mRNA在细胞总RNA中的比例很低，需要大量的样本用于mRNA的提取，这就大大

限制了稀有样本的检测。

细胞mRNA的提取—以Promega公司的PolyATtract System 1000为例

基本原理

任何一种RNA提取方法都包括以下四个步骤：1）高效裂解细胞或组织；2）变性核蛋

白复合物；3）灭活内源性的RNase活性；4）纯化RNA。所有这些步骤中最重要的是，立

即灭活细胞裂解后从膜包围的细胞器中释放出的内源性RNase。

用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。

PolyATtract® System 1000利用硫氰酸胍（GTC）和β-巯基乙醇来灭活细胞抽提液中的核

酸酶，利用GTC和SDS来变性核蛋白复合物。核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解

离下来，使得RNA从溶液中释放出来，并与蛋白质分离。最终GTC的浓度允许mRNA的

poly(A)与合成的生物素化的Oligo(dT)探针退火，但仍能完全抑制细胞内的RNases。短暂

的离心完成杂交，并去除细胞碎片和沉淀的蛋白质。离心后，用Streptavidin

MagneSphere

®

Paramagnetic Particles (SA-PMPs)来捕获生物素化的Oligo(dT) :

mRNA杂交分子。先用高严谨性的条件洗涤磁珠，然后用Nuclease-Free Water洗脱，便

可获得纯化的mRNA。

实验材料

实验耗材 细胞刮子、微量移液器、量筒、烧杯、盐水瓶、止血钳、锡箔纸、药勺；

进口Tip、Tube

试剂 NaAc、NaCl、KCl、Na

2

HPO

4

、KH

2

PO

4

、无水乙醇、异丙醇等，均为分析

纯，且最好是新的未开封的；

DEPC，焦碳酸二乙酯，购自Invitrogen公司；

PolyATtract System 1000，Cat# Z5400购自Promega公司。

实验前的准备（包括溶液的配制及无RNAase和DNAase环境的建立）

1.无RNAase和DNAase环境的建立

 玻璃制品、铁制品、塑料制品和电泳槽

无菌的一次性使用的塑料制品（进口）基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于

制备和贮存RNA。但为了保险起见，将它们装入无RNase和DNase的铁饭盒（干烤：

300℃，4h），加0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡，37℃，至少2h，或室温

下过夜。随后，高压蒸汽灭菌，15 psi（1.05 kg/cm

2

），15 min。再烘干，100℃，2～

3h。实验室用的普通玻璃器皿、铁制品和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于

300 ℃干烤4 h或更长时间（玻璃器皿、铁制品，若是敞口的器皿，需用锡箔纸封口后再

干烤）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶

液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放

置２小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15 min。在15 lbf/in

2

(1.034x10

5

Pa)

高压蒸气灭菌15 min。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化

作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。

用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％

的H2O2溶液，于室温放置10 min，然后用0.1％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最

好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实

验专用。

附 DEPC

DEPC是具有高度活性的烷基化试剂，它通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏

RNase的酶活性。虽然DEPC是RNase的强烈抑制剂，但是它的作用并不是绝 对的。

在水溶液中，DEPC迅速水解为CO

2

和乙醇，在pH6.0的磷酸缓冲液中半衰期为20

min，在pH为7.0的磷酸缓冲液中为10 min。这种水解过程通过Tris和其它胺类大大加

速，它们自己本身也在这一过程中消耗了。因此，DEPC不能用来处理含有这些缓冲液的

溶液。无亲核体（例如：水和乙醇）的DEPC样品是非常稳定的，但是甚至小量的上述溶

质也能导致DEPC完全转化成碳酸二乙酯。由于这个原因，DEPC应该防潮，并小份储存

于干燥的条件下，在开启瓶子前，应该使瓶子达到足够的温度。

 溶液的处理

用干烤过的药匙称取试剂，用DEPC处理过的无菌去离子水溶解和稀释试剂，将溶液

装入无RNase的玻璃器皿。可能的话，溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12 h，

然后于100℃加热15 min或在15 lbf/in

2

(1.034x10

5

Pa)的高压下蒸气灭菌15 min。

DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液。可存

几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。

 操作者及其操作环境

RNase最主要的潜在污染源是操作者和灰尘。操作者应该戴一次性手套，并勤换手套；

应该戴口罩和帽子，尽量不要对着RNA样品呼气或说话。灰尘中含有细菌和霉菌，所以

应该保持操作环境整洁。对于多次使用的试剂，最好无菌操作。

2.溶液的配制

 无DNase和RNase的去离子水

将新鲜制备的去离子水装入干烤过的盐水瓶，加入DEPC，使其终浓度达到0.1%，振

荡混匀后，置于37℃过夜。高压蒸汽蒸汽灭菌，15 lbf/in

2

(1.034x10

5

Pa)，15 min。

 3M 醋酸钠溶液（100 ml）

NaAc•3H

2

O 40.81 g

新鲜制备的去离子水 80 ml

搅拌溶解后，用冰乙酸调pH至5.2，约需1.85 ml，再加去离子水调至100 ml。加

入100 ul DEPC，振荡混匀后置于37℃过夜，然后高压蒸汽灭菌，15 lbf/in

2

(1.034x10

5

Pa)，

15 min。

 PBS（200 ml）

NaCl 16 g

KCl 0.4g

Na

2

HPO

4

·12H

2

O 7.26 g

KH

2

PO

4

0.48 g

用160 ml DEPC处理过的无菌去离子水溶解上述试剂，用浓HCl调pH至pH7.4，

再用DEPC处理过的无菌去离子水定容至200 ml。高压蒸汽灭菌，15 lbf/in

2

(1.034x10

5

Pa)，15 min。

 70%乙醇 采用DEPC处理过的无菌去离子水配制。

 无血清培养基1640

实验设计

可以根据起始材料的量来确定试剂的用量。对于培养细胞，每次mRNA提取所用的细

胞数量上下限分别为10

8

和10

6

。对于纯化的mRNA，则分别用紫外分光光度计测定数量

和纯度，用凝胶电泳分析完整性。

操作步骤及每步需注意的事项

按照PolyATtract System 1000的protocol进行，并作了些修改，具体如下。

1.收集细胞

 清洁工作

用干净纱布擦拭桌面；

用酒精棉球擦拭桌面、微量移液器、试管架、止血钳、磁架等；

 预热试剂

将试剂盒中的下列组分取出置于桌面上，暖至室温。

GTC Extraction Buffer、Biotinylated Oligo(dT) Probe、Nuclease-Free Water、

SSC（0.5×）

 洗涤细胞 先用无血清培养基1640洗涤细胞，10 ml/T75瓶/次，共3次。

 刮细胞 每个培养瓶中分别加入6 ml 1640，用细胞刮子刮下细胞，注意培养瓶的

四个角。镜检判断是否还有残余细胞。将刮下的细胞连同1640转移至50 ml离心管。用

1640洗涤培养瓶，以回收残留在培养瓶中的细胞，尽量减少损失。1640的用量为：6 ml/5

瓶。然后将液体与上一步合并。

 洗涤细胞 离心，1,500 rpm，10 min。去上清，加入预冷的PBS，轻轻重悬细

胞沉淀，并使细胞完全分散。离心，1,500 rpm，10 mim，去上清，备用。期间，预热

Dilution Buffer至70℃。

2.裂解细胞 在一个新的无RNase和DNase污染的50 ml离心管中混和4 ml GTC

Extraction Buffer和164 ul β-巯基乙醇。Vortex混匀后加到含细胞沉淀的50 ml离心管

中，高速Vortex至细胞完全裂解。

3.探针退火

 在一个新的无RNase和DNase污染的50 ml离心管中分别加入8 ml 70℃预热的

Dilution Buffer和164 ul β-巯基乙醇。Vortex混匀后加到细胞裂解液中，上下颠倒混匀。

 加入10 ul Biotinylated Oligo(dT) Probe，混匀后70℃水浴5 min。

 将裂解液转移至12个1.5 ml eppendorf管中，室温下离心，12,000 rpm，10 min

（离心前平衡离心机温度至室温。在室温下离心目的是避免溶液中的盐分和去污剂的析

出）。

 将上清分别转移至12个新的1.5 ml eppendorf管中，室温下离心，12,000 rpm，

10 min。

4.洗涤偶联有链霉亲和素的磁珠SA-PMPs

可以安排在步骤3中的离心期间进行。

 轻摇瓶子，使SA-PMPs完全重悬。

 转移6 ml SA-PMPs至一个新的RNase Free的50 ml离心管中，将离心管置于磁

架上，慢慢放平。待磁珠完全聚集到管子一侧时，小心倒掉储存缓冲液。

 加入6 ml 0.5×SSC重悬SA-PMPs，磁架捕获后倒掉上清，具体作法同上一步。

 重复洗涤步骤2次，即洗涤3次，然后加入6 ml 0.5×SSC重悬SA-PMPs。

5.捕获和洗涤磁珠

 当步骤3完成后，小心转移上清至洗涤过的SA-PMPs中，上下颠倒混匀。注：勿

吸沉淀。吸到沉淀会导致整个系统的效能。

 室温下孵育10 min。

 用磁架捕获SA-PMPs，将上清转移至一个新的RNase Free的50 ml离心管中，

冰浴保存至确认有满意的结果为止。

 用1.8 ml（分两次，第一次用1 ml，第二次用0.8 ml）0.5×SSC重悬SA-PMPs

并转移至一个2 ml mRNA User Tube中。用磁架捕获磁珠后，用微量移液器小心地移去

上清。

 重复洗涤4次，即共洗涤5次。最后一次洗涤完成后，尽可能地移去上清，但不扰

动SA-PMPs。注：洗涤时应远离磁架，同时应上下颠倒2 ml mRNA User Tube以达到

充分洗涤SA-PMPs为止。

6.洗脱mRNA

 加入总量为1 ml的RNase Free Water，上下颠倒数次后，室温下孵育3 min。用

磁架捕获SA-PMPs后，将上清转移至2个1.5 ml eppendorf管中，每管0.5 ml，分别

编号为1，2。

 重复上一步骤一次，eppendorf管的编号分别为3，4。

 往2 ml mRNA User Tube中加入1 ml RNase Free Water，冰浴保存至mRNA

产量和纯度的测定完成为止。

7.沉淀mRNA

 往1，2，3，4号eppendorf管中分别加入50 ul 3 M NaAc和500 ul 异丙醇，

上下颠倒混匀后，-20℃沉淀过夜。

 4℃下离心，13,000 rpm，25 min。离心完成后，看不到沉淀，但磁珠可指示沉淀

的位置。

 沿着与沉淀面相背的一侧吸出上清。注意勿吸丢沉淀。

 分别加入1 ml 70%乙醇。注意：用微量移液器轻轻而又缓慢地将70%乙醇从与沉

淀面相背的一侧加入。

 4℃下离心，13,000 rpm，25 min。

 沿着与沉淀面相背的一侧缓慢地将70%乙醇吸去。注意勿吸丢沉淀。

 室温下晾干。注意：沉淀不能太干，否则可能难溶解。

 用5 ul RNase Free Water溶解沉淀。溶解沉淀时，用微量移液器反复吸放，以达

到充分溶解的目的。

8.紫外分光光度计测定mRNA的数量和纯度

9.琼脂糖凝胶电泳分析mRNA的完整性

的保存

短期保存（<30 d）：以0.5-1.0 mg/ml的浓度溶解在水中，并保存于-70℃。

长期保存（>30 d）：将RNA沉淀保存在70%乙醇中，置于-70℃。

结果观察及分析的原则

1）紫外分光光度计测定mRNA的数量和纯度

280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度

和蛋白等有机物的值。对于纯净的样品，A

320

一般是0，A

260

/ A

230

的比值大于2.0。若

A

260

/ A

230

小于2，则表明样品中仍存在GTC或β-巯基乙醇。对于A

260

/ A

280

（Ratio，R），

当R>1.82时，说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用

Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，

溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定要不要使用这

份RNA（不同的实验对RNA质量的要求不同）。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核

酸了。

测定mRNA的纯度时，应采用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液稀释样品。测定

mRNA的数量时，则采用RNase Free Water稀释样品，因为只有当用水稀释样品时，A

260

和浓度之间的换算关系才能成立。注：只有当样品的纯度符合要求时，根据测定值换算出

的浓度才比较准确。此外，吸光值最好介于0.1～1.5。

2）琼脂糖凝胶电泳分析mRNA的完整性

一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的。但如果仅仅是为了检测RNA的质量，没

有必要进行如此麻烦的实验，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的在于检测mRNA

smear的完整性。一般的，mRNA smear范围大约是0.5～8.0 kb（不同的组织可能不一

样），且集中在2.0 kb。可能会存在极少量的核糖体RNA，但这并妨碍下游的操作。

3）保温试验：确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。

如果mRNA比较多，则可以进行保温实验。按照样品浓度，从mRNA溶液中吸取两

份1000 ng的mRNA加入至0.5 ml的离心管中，用pH7.0的Tris缓冲液补充到10μl的

总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中，保温1 h。另一份放置在-20℃

冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳

条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合上一个条例的描

述），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃

保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。

实验成功或失败的关键因素

 创造一个无RNA酶的环境，尽量避免外源性的RNA酶污染。

 操作要迅速，尤其是当RNA脱离了众多变性剂提供的保护环境之后。