蛋白质分子定向进化其他方法

蛋白质分子定向进化其他方法

自然界在长期的进化过程中．产生了许多具有重要功能的符合人们需要的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，则往往不能满足人们的需要。为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工业的需要。自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过程。

自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计（rational design），但蛋白质结构的复杂性极大地增加了合理设计的难度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化（molecular directed evolution）策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。

定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性（突变和／或重组）；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这个过程直到达到目标。该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。

蛋白质定向进化通常分三步进行：基因随机诱变、体外重组和筛选。每一步都可以有多种方法。

常见的定向进化方法有：①易错PCR技术②DNA改组技术③外显子改组④交错延伸重组⑤随机引物体外重组法（RPR）。当然还有其他的方法，下面就来给大家一一介绍。

一、随机诱变

㈠化学诱变剂介导的随机诱变

体外随机诱变也可在65℃下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，然后用限制性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆到表达载体中进行功能的筛选。

㈡由致突变菌株(mutator strain)产生随机突变

美国stratagene公司构建了一株DNA修复途径缺陷的大肠杆菌突变株XLl-Red，它体内的DNA突变率比野生型高五千倍。将带有要突变基因的质粒转化到XLl-Red菌株内复制过夜，在此过程中会产生随机突变。每两千个碱基中通常约有一个碱基置换。将带有突变过的基因的质粒转化到表达系统中进行筛选。

连续几代的随机突变和筛选的方法是从每一代中挑选出一个最佳的突变体作为下一代的亲本。通过积累氨基酸的正突变，可加快进化的进程。

㈢定点突变和定点饱和突变技术

定点突变技术(Site—directed mutagenesis)一般用于对DNA分子特定位点的突变，所以需要预先知道野生型基因序列。早在1978年Michael Smith就运用寡核苷酸进行定点突变。定点突变的基本原理是首先合成一段含有突变碱基的DNA引物，然后这段合成的引物可以杂交到包含有目的基因的单链

DNA上，用DNA聚合酶将剩余片段进行延伸，得到的双链分子转入到宿主细胞并被克隆，最后用特定的筛选方法将突变子筛选出来。定点突变技术有盒式诱变和多种基于PCR的突变方法，最常见的有重叠PCR等方法。当靶位点氨基酸分别可被其它19种氨基酸代替而得到突变子的方法，称为定点饱和突变技术，此方法是要着重寻求靶位点的最适氨基酸。定点突变和定点饱和突变技术的运用，能极大地丰富突变体库的多样性。

㈣组合活性中心饱和突变试验

组合活性中心饱和试验(combinatorial active．site saturation test，CAST)的基本原理是：在酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接近的氨基酸对作为突变位点，选择的氨基酸对必须是在侧链基团取向上具有潜在的协同作用。因此，突变后才可能获得更具有潜力的突变体。这是单点突变不能做到的。如果选择的氨基酸对应的位置是n，则第2个氨基酸的选择遵循以下的原则：如果第n个氨基酸在环上，则另一个氨基酸选择第n+1位；若在β折叠上则选择第n+2位，若在310螺旋上，则选择第n+3位；若在α螺旋上，则选择第n+4位。对于CAST突变体库容量的计算：每突变一对氨基酸要进行饱和随机突变，即这一对氨基酸要突变成20种氨基酸的任何一种。以NNK(N代表任何一种核苷酸，K代表是G或T)作为突变的碱基形式，则有322=1

024种不同的组合，而氨基酸则可突变成202=400种不同的组合。因此，要将每个库的所有突变的覆盖率达到95％，则每个库至少要挑3000个克隆子。

此外，近年来还发展出了更多的、新颖的无性突变技术。例如，三核苷酸突变(TriNex)，随机插入-删除突变(RID)，序列饱和突变(SeSaM)以及它的改进方法SeSaM—Tv+。这些方法都是为了能最大程度的增强突变体库的多样性，丰富并延伸无性突变的方法手段。

二、基因体外重组

㈠限制性酶切-再连接介导的基因重组(recombining the genes by

restriction and religation)

利用限制性内切酶对欲重组的两个以上DNA序列进行酶切，然后在连接酶的作用下随机重新连接起来，可实现DNA分子问的重组。实验证明，简单的酶切-再连接可进一步提高对硝基苯酯酶的活性。但如果两个正突变处于同一段限制性酶切片段上，则无法将它们重组于同一序列中。

㈡基因家族改组

在基因改组的基础上，1998年由Crameri等提出了基因家族改组技术(DNA family shuffling)，至此才是真正的有性重组的开始。基因家族改组与单基因改组最大的区别在于出发序列的同源性。利用基因家族同源序列进行DNA改组，实现同源重组。由于同源序列是经过自然选择保留下来的相对有益或无害的片段，所以基因家族改组的突变机率和改组效率明显提高，体现了基因的多样性。

㈢过渡模板随机嵌合生长

过渡模板随机嵌合生长（random chimeragenesis on transient templates，RACHITT）技术是与DNA shuffling概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术。它不包括热循环、链转移或交错延伸反应，而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接（图2）。其中的悬垂切割步骤使短片段（比DNase消化片段还短）得以重组，明显提高了重组频率；如果在片段重组前后采用错误倾向PCR还可引入额外点突变。CoCo等首次报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶，产生的嵌合文库平均每个基因含14个交叉，重组水平比DNA shuffling类方法（1~4个交叉）高出

几倍；并且可在短至5bp的序列同一区内产生交叉。这种高频率、高密度的交叉水平是DNA shuffling所难以达到的。

㈣酵母增强组合文库

酵母增强组合文库（combinatorial libraries enhanced by

recombination in yeast，CLERY）是一个真核基因家族shuffling策略。其原理是将体外DNA shuffling程序与接下来的酵母体内重组缔合起来，构建高丰度低亲本水平的重组文库：直接以含目的基因的质粒作为体外shuffling的模板；shuffling后基因产物与线性化的酵母表达载体共转化酵母细胞启动体内重组事件，同时表达功能性重组子直接用于筛选。Truan等用该法重组人细胞色素P450 1A1和1A2，所得文库含86%的嵌合基因，大大提高了文库丰度；另外，用单链DNA做shuffling的模板可进一步降低文库中的亲本比率。该法为蛋白质结构／功能研究、多组分真核复合酶活力的调控提供了一个新的有力工具。

㈤渐增切割法产生杂和酶

尽管DNA shuffling介导的重组已成为定向进化创建高质量序列多样性的重要工具，但它们通常不能用于重组同源性低于70%~80%的序列。而自然界大多数同源序列具有比这个数目低得多的相似性。为了解决这个问题，Benkovic研究组建立了渐增切割法产生杂和酶（incremental truncation for the

creation of hybrid enzymes，ITCHY）及Thio-ITCHY（α-硫代磷酸核苷酸介导的ITCHY）方法来产生不依赖于DNA序列同源性的重组文库。ITCHY的基本原理是：控制核酸外切酶#的切割速度不大于10碱基／min，然后间隔很短时间连续取样终止反应，以获得一组依次有一个碱基缺失的片段库；然后将基因A的一组随机长度的5’端片段与基因B的一组随机长度的3’端片段随机融合产生杂合基因文库。但由于该方案冗长繁琐，Lutz等又提出了Thio-ITCHY方法：首先将待PCR反应或单链模板引伸反应将α-硫代磷酸核苷酸随机引入产物中，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，接下来的切割反应会在此处随机终止，连接切割产物即产生随机交叉文库.该法操作便利，同时也可引入随机点突变。此外，ITCHY/Thio-ITCHY不依赖DNA序列同源性，可在非序列同一区内产生活性融合子。迭代ITCHY或对其文库进行shuffling还可以创造多个交叉。

㈥不依赖序列同源性的蛋白质重组

尽管上述ITCHY可以进行不依赖于序列同源性的重组，但它是一个随机长度片段与另一个随机长度片段相融合，结果文库中基因长度不再保守，子代中功能杂合子的比率很低。要想提高功能杂合子所占比例，须使交叉发生在具有相似结构环境的位置，但由于缺乏足够的序列相似性，同源重组不能发挥作用，因此Sieber等提出了不依赖序列同源性的蛋白质重组（sequence

homology-independent protein recombination，SHIPREC）方法：通过琼脂糖凝胶电泳回收单基因长度随机片段，保证了子代嵌合体长度的保守性，使交叉保持了适当的序列匹配，主要发生在结构上相关的位点，交叉点处的两个氨基酸仍处于它们在亲本蛋白质结构中的位置，从而提高了文库中阳性克隆的比例。该法可以在低序列同一性甚至无序列同一性的同源蛋白质间创造具有单交叉的杂合蛋白质组合文库。迭代SHIPREC可以产生多个交叉。

随着酶分子定向进化的发展，在常规的定向进化方法的基础上，又相继开发出另一些新方法，如设计的寡核苷酸装配(assembly of designed

oligonucleotides，ADO)、诱变和单向重组(mutagenic and unidirectional

reassembly，MURA)、随机插入-删除链交换突变(random insertional

deletional strand exchange mutagenesis，RAISE)、基于Y连接的构件改组(Y-ligation-based block shuffling，YLBS)、合成改组(synthetic

shuffling)等新方法都有改造蛋白的成功案例，也为更好的进行定向进化提供了强有力的工具和指导思想。

三、文库筛选策略

一旦多样性文库构建好后，定向进化实验成败与否的关键则在于“要有针对目的改造特征的高效筛选方案”。近几年，与创建多样性重组文库的发展相适应，在高流通量和超高流通量筛选技术方面也取得另人瞩目的成就。其中核糖体展示技术与mRNA展示技术，由于在体外无细胞翻译体系中进行，不受细胞转化效率的限制，大大提高了文库容量和筛选通量（1012~1014）。它们的原理是通过筛选靶蛋白-核糖体-mRNA三元复合物或靶蛋白-mRNA二元复合物，将基因型与表型直接偶联起来，并利用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集。利用此法进化单链抗体可变区scFv片段，获得

亲和力提高40倍的变异株。

其他高通量筛选方法，如细胞表面展示技术和噬菌体表面展示技术；将靶活力与转录信号相偶联的三杂交体系；以发光信号为指示的反射增进系统；利用荧光信号的荧光共振能量转换仪（FRET），结合荧光激活细胞筛选仪（FACS），每小时可筛选60000个细胞。最近Chadessy等还报道了一种隔室化自复制技术，通过一个只复制其自身基因的聚合酶组成的简单反馈环将体外进化与筛选有机结合起来，使阳性克隆得到快速、高效的富集，获得热稳定性提高11倍，肝素抗性提高130多倍的Taq DNA聚合酶突变株。

在硬件设备方面，1536和3456孔板以及多通道多波长检测仪的出现、每秒钟分配几千滴皮升级样品的非接触式压电配样仪的问世等都大大提高了样品处理速度。

定向进化的意义

定向进化不仅在工业、医疗方面对蛋白质的改造具有重要的意义，而且，它也非常适合于基础理论的研究。对蛋白质分子进化得到的突变体进行分析，为研究蛋白质的结构和功能的关系提供了新的工具。天然蛋白质序列中往往有很多是随机遗传漂移，而不是功能性的适应。例如，从适应不同环境的物种中提取出的蛋白质经常有几十个氨基酸的不同，其中只有一小部分是与特定功能差异有关的。大量的中性突变只能干扰科学家辨别分子的规律。在实验室的进化实验中，种系很清楚，而且突变主要是适应性的。Amold等人使用高保真DNA改组成功地区分出基因中的功能性和非功能性突变。通过定向进化来研究蛋白质的结构和功能的关系，可为蛋白质的理性设计提供理论依据。

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